| Tez Künye | Durumu | ||
| Investigation of potential ERK-dependent phosphorylation sites on SIK2 / SIK2 üzerindeki ERK’e bağlı olası fosforilasyon bölgelerinin incelenmesi Yazar:EMİRHAN TAŞÖZ Danışman: PROF. DR. KOYAŞ BUĞRA Yer Bilgisi: Boğaziçi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2016 80 s. | ||
| Laboratuarımızda daha once yapılan çalışmalar, bir serin/treonin kinaz olan SIK2’nin FGF’e bağlı MAPK yolağının negatif regüle eden bir geri-besleme mekanizmasında rol aldığını önermektedir. SIK2’nin FGF2 ile kısa süreli uyarımda Müller hücrelerindeki hızlı aktivite ve treonin fosforilasyon artışının ve in vitro olarak ERK’in SIK2’yi direk olarak fosforlamasının gösterilmiş olması nedeniyle, ERK’in SIK2’nin aktive edici kinazı olduğu düşünülmektedir. Bu çalışma, hipotezimizi destekleyerek, FRS2 ve SOS1’in de SIK2’nin FGF2 stimüle edilen Müller hücrelerinde etkileştiği sinyal kompleksinde bulunduğunu göstermiştir. İkinci aşamada SIK2 üzerindeki ERK’e bağlı potansiyel fosforilasyon bölgelerinin incelenmesi üzerine yoğunlaşılmıştır. Bu amaçla SIK2 üzerindeki olası ERK hedef amino asitleri biyoinformatik yaklaşımla belirlenmiş ve bu aday amino asitler T758 ve T863 in vitro mutagenez yöntemi ile alanine değiştirilmiştir. Deneylerde ERK tarafından gerçekleştirilen fosforilasyonu SIK2’nin otofosforilasyon aktivitesinden ayırabilmek için bu mutasyonları üretirken kinaz inaktif SIK2 kullanılmıştır. HEK 293T hücrelerinde ürettirilen KI-SIK2 ve KI-SIK2’nin mutant versiyonları immünopresipitasyon ile izole edilmiştir. İzole edilen SIK2 örnekleri aktif ERK2 ile birlikte in vitro kinaz deneylerinde kullanılmıştır. Mutant KI-SIK2’ler ile KI-SIK2’nin ERK fosforilasyon düzeyleri arasında önemli bir fark olmadığını göstermiş olan veriler T758 ve T863 amino asitlerinin ERK’in hedef noktaları olmadığına işaret etmekterdir. Olası atipik ERK motiflerinin tanımlanabilmesi amacıyla kütle spektrometirisi analizi de yapılmış, ancak SIK2’nin kapsama seviyesindeki düşüklükten dolayı sonuç alınamamıştır. Bu çalışmalara ek olarak SIK2-Gab1 ilişkisinin daha derinlemesine incelenmesi yolunda ilk adım olarak bu proteinlerin bakteriyel anlatım yapıları da üretilmiştir. | |||
| The previous studies from our laboratory suggested that the serine/threonine kinase SIK2 is involved in a feedback mechanism downregulating the FGF-dependent MAPK pathway. As it has been shown that the activity of SIK2 is rapidly increasing with concomitant threonine phosphorylation in response to transient FGF2 stimulation in Müller cells and that ERK directly phosphorylates SIK2 in vitro, ERK is proposed to be the activatory kinase of SIK2 in this regulation scheme. This study revealed that FRS2 and SOS1 are also present in the same signaling complex with SIK2 in FGF2 treated Müller cells, supporting our hypothesis. In this study, we focused on the investigation of the potential ERK-dependent phosphorylation sites on SIK2. For this purpose, the two putative ERK target residues T758 and T863 on SIK2 sequence that were identified by bioinformatic analysis were mutated to alanine residues by site-directed mutagenesis. The kinase inactive SIK2 was used for the generation of these mutants to distinguish phosphorylation by ERK from the autophosphorylation activity of SIK2 itself in further assays. KI-SIK2 and the mutant versions of KI-SIK2 were expressed in HEK 293T cells and purified by immunoprecipitation. Purified SIK2 samples were used in in vitro kinase assay with active ERK2. As the mutant forms of KI-SIK2 were phosphorylated at the same level with the KI-SIK2, the results of the in vitro kinase experiment indicated that neither of these threonine residues (T758 and T863) are targeted by ERK2, raising the possibility of non-canonical motifs as ERK targets. Thus, mass spectrometry analysis was also carried out to identify the ERK-dependent phosphorylation sites on SIK2. However, due to low coverage of SIK2 sequence, no informative data was obtained. In the context of this study, as a first step for the further investigation of Gab1-SIK2 interactions, bacterial expression constructs of these proteins were generated. | |||