| Tez Künye | Durumu | ||
| Molecular description of medicinal leech (Hirudo verbana carena, 1820) based on DNA sequences / DNA dizilerine dayalı olarak tıbbi sülük (Hirudo verbana carena, 1820)’ün moleküler tanımlaması Yazar:AL-HUSSEIN HAMEED HUSSEIN OKBI Danışman: PROF. DR. MEHMET OĞUZ ÖZTÜRK Yer Bilgisi: Afyon Kocatepe Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2023 85 s. | ||
| Amaç: Bu çalışmada amaç; Karamık Gölü’nden Hirudo verbana örneklerinin anatomik, morfolojik özellikleri ile 18S rRNA ve mitokondriyal sitokrom c oksidaz alt ünite I lokuslarının (mt COI) sekans verilerini tanımlamaktır. Hirudo verbana türünün moleküler taksonomik konumu, 18S rRNA ve mt COI genetik dizi verileri ile test edilecektir. Sonuçlar NCBI veri tabanındaki Hirudo verbana izolatları ile uyumluluk analizine tabi tutulacaktır. Araştırma sonuçları ile Hirudo verbana türünün genetik özelliklerine, DNA barkod kütüphanesine, taksonomik kökenine ve evrimsel konumunun belirlenmesine katkıda bulunulacaktır. Yöntemler: Hirudo verbana örnekleri Karamık Gölü’nden toplandıktan sonra, fiksasyon ve muhafaza için %95 etanol içine konulmuştur. Hirudo verbana örneklerinin anatomik ve morfolojik incelemeleri için Olympus SZ30 stereo mikroskop, Olympus CH20 ışık mikroskobu ve ZEISS Axio Imager mikroskobu kullanılmıştır. Moleküler çalışmalar için Hirudo verbana’ya ait 16 örneğin kaudal vantuzları çıkarılmış ve Gene Matrix Tissue kiti kullanılarak DNA ekstraksiyonu yapılmıştır. DNA izolasyonundan sonra, 18S rRNA ve mt COI’nin yaklaşık 700 bazlık bölgesini çoğaltmak için tek adımlı PCR yapılmıştır. 18S bölgesi için C (5ʹ-CGG TAA TTC CAG CTCCAATAG-3ʹ) ve Y (5ʹ-CAGACAAATCGCTCCACCAAC-3ʹ) primerleri ve mt COI bölgesi için LCO 1490 ve HCO 2198 primerleri kullanılmıştır. ABI 3730XL Sanger dizileme cihazı (AppliedBiosystems, Foster City, CA) ve BigDyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) (Macrogen-Holland) kullanılarak mt COI dizilemesi için doğrudan LCO 1490 ve HCO 2198 primerleri ile Hirudo verbana’nın saflaştırılmış PCR ürünlerinden dizileme yapılmıştır. Nükleotid dizileri, Mega 7.0 çoklu dizi hizalama ClustalW2 yazılımı yardımıyla hizalanmıştır. Gen dizilerinin homoloji araştırması için FASTA programı ve BLAST algoritması kullanılmıştır. Genetik uzaklıkları hesaplamak için Mega 7.0’da Tamura Nei’nin çift yönlü silme yöntemli iki parametreli modeli kullanılmıştır. Filogram analizinde Mega 7.0’da Maksimum Olabilirlik (ML) yöntemi kullanılmıştır. Bulgular: Bu çalışmada incelenen Hirudo verbana örnekleri Karamık Gölü’nden toplanmıştır. Örnekler anatomik ve morfolojik özelliklerine göre tanımlanmıştır. Daha sonra, aynı örneklerin mtCOI (OM010329, OM010332-37, OM033510) ve 18SrRNA (OK091623-32) gen lokuslarına ait 641-736 bp kısmen anlamlı nükleotid dizileri özdeş olarak tanımlanmış ve GenBank’a kaydedilmiştir. İkili karşılaştırma yöntemiyle elde edilen mtCOI dizilerine göre, bu çalışmada tanımlanan Hirudo verbana izolatları ile GenBank’ta kayıtlı Hirudo verbana izolatları arasında tam bir uyum gözlenmiştir. Böylece, bu çalışmada tanımlanan Hirudo verbana izolatlarının mt COI sekans sonuçları, Karamık Gölü’nden toplanıp anatomik ve morfolojik özelliklerine göre tanımlanan Hirudo verbana türünün taksonomik konumunu doğrulamıştır. Bu araştırmada üretilen 6 izolatın (OM010329, 32, 33, 35, 37, OM033510) mtCOI lokusunun 431 nolu nükleotidinde, 1 varyasyon (A > G) gözlenmiştir. Bununla birlikte, OM010334 ve OM010336 izolatların mtCOI dizilerinde ve diğer tüm 18SrRNA gen dizilerinde herhangi bir nükleotid varyasyonu gözlenmemiştir. Hirudo verbana örneklerinin mtCOI gen dizilerindeki nükleotid yüzdeleri (A %24,5-26,0; T %24,3-25,2; G %28,1-29,6; C %20,9-21,6) dir. 18S rRNA gen dizilerindeki nükleotid yüzdeleri (%26,9-27,2 A; %26,7-26,8 T; %28,3-28,6 G; %17,4-17,9 C) dir. Maksimum olabilirlik analizi değerleri Hirudo izolatları arasında filogram oluşumunu güçlü bir şekilde desteklemiştir. ML analizi sonucunda, bu çalışmada elde edilen Hirudo verbana izolatına ait OM010337.1 ve OM033510.1 kendi aralarında yakın konumlanma göstermiştir. Ardından, çalışma izolatımız (OM010336.1) ile bir diğer çalışma izolatımız (KU216244.1) arasındaki ilişkinin de aynı yakın konumlara sahip olduğu gösterilmiştir. OM010334.1 izolatından sonra tek bir dal (JN083798.1) ve ardından bir grup diğer çalışmalardan AY763150.1 ve EF446694.1 izolatları yakın konumlanma göstermiştir. Bu konumlandırmayı tek bir dal (AY63151.1) takip etmiştir. Ardından diğer Hirudo türleri (KY989460.1 Hirudo orientalis, AY763148.1 Hirudo medicinalis, AY763155.1 Hirudo troctina ve KU216240.1 Hirudo sulukii) her biri tek dal olarak konumlanmıştır. Son dal olan Erpobdella montezuma (GQ368760.1) dış grup olması nedeniyle ağaçta en sonda yer almıştır. Sonuç: Çalışma sonucunda Karamık Gölü’nden elde edilen Hirudo verbana türünün anatomik ve morfolojik özelliklerinin yanı sıra, mt COI ve 18S rRNA gen dizileri ilk defa bu çalışmada tanımlanmıştır. Mevcut çalışma sürecinde elde edilen Hirudo verbana örneklerinin mt COI dizileri kendi aralarında (OM721927-30 ve OM033510) ve NCBI veritabanındaki Hirudo verbana izolatlarının mtCOI lokus dizileri (AY763151, AY763150, JN083801, KT692947, EF446694, KU216244) ile tam bir uyum göstermiştir. Böylece, anatomik ve morfolojik özelliklerine göre türü tanımlanan Karamık Gölü Hirudo verbana örneklerinin moleküler taksonomik konumu, mtCOI sekans verileri ile doğrulanmıştır. Ayrıca, bu çalışma sonuçları ile Hirudo verbana türünün genetik özelliklerinin, DNA barkod kütüphanesinin, taksonomik kökeninin ve evrimsel homojenliğinin belirlenmesine katkıda bulunulmuştur. | |||
| In this study, 641-736 bp partially distinctive nucleotide sequences belonging to the mtCOI and 18S rRNA gene locus from Hirudo verbana samples were identified as identical and registered in GenBank (OM010329, OM010332-37, OM033510, OK091623-32). Among the mtCOI nucleotide sequences of 6 of these isolates (OM010329, 32, 33, 35, 37, OM033510), 1 variation (A > G) was observed at nucleotide 431. The nucleotide percentages in the mtCOI gene sequences of Hirudo verbana samples are (A 24.5-26.0%; T 24.3-25.2%; G 28.1-29.6%; C 20.9-21.6%). The nucleotide percentages in the 18S rRNA gene sequences are (26.9-27.2% A; 26.7-26.8% T; 28.3-28.6% G; 17.4-17.9% C). According to the mtCOI sequence dataset distance matrix obtained by the Pairwise comparison method, there was a complete agreement between the H.verbana isolates identified in this study and the H.verbana isolate registered in the GenBank. mtCOI gene sequence results of the isolates confirmed the taxonomic position of H.verbana, which was defined according to its anatomical and morphological features. As a result, mtCOI and 18S rRNA gene sequences were defined for the first time in this study on the samples belonging to H.verbana species in Karamık Lake, and it contributed to the determining the genetic characteristics of this species on a local and global scale. | |||