| Tez Künye | Durumu | ||
| Modelling hTERT cancer-associated mutations via crispr-Cas9 in 3d liver organoids / Kanser ilişkili hTERT mutasyonlarının 3d karaciğer organoidlerinde crıspr-Cas9 ile modellenmesi Yazar:CANAN ÇELİKER Danışman: PROF. DR. ŞERİFE ESRA ERDAL BAĞRIYANIK ; DOÇ. DR. ŞERİF ŞENTÜRK Yer Bilgisi: Dokuz Eylül Üniversitesi / İzmir Uluslararası Biyotıp ve Genom Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2019 93 s. | ||
| İnsan TERT (hTERT) promotör mutasyonları C-124T ve C-146T, hepatoselüler karsinomda en sık görülen genetik değişikliklerdir. Bu mutasyonlar hepatokarsinogenezde erken olaylardan biri olarak kabul edilir ve hastalık progresyonu ile anlamlı şekilde ilişkilidir, ancak TERT’in tümörögeneze yol açan mekanizması net bir şekilde keşfedilememiştir. Son yıllarda gelişen üç boyutlu (3D) organoid teknolojileri ile, laboratuvar koşullarında, karaciğerde dahil çeşitli organların, küçültülmüş ve/veya basitleştirilmiş bir yapısal ve işlevsel versiyonunu üretmek mümkün hale gelmiştir. Buna göre, biz EpCAM pozitif endodermal hücrelerin ara basamak olduğu, insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı hepatik organoid (eHEPO) kültür sistemi ürettik. eHEPO’lar 2 hafta içinde üretilebilir ve olgun hepatositlere farklılaşma kapasitesi kaybı olmadan uzun süre büyütülebilmektedir. Bu çalışmada, CRISPR-Cas9 bazlı genom düzenlemesini kullanarak hepatik organoidlerde hTERT promotör mutasyonlarını oluşturmayı amaçladık. TERT promotörünün düzenlenmesi için “pop-in pop-out” stratejisi adı verilen homoloji yönlendirmeli tamir (HDR) temeline dayanan CRISPR-Cas9 sistemi kullanıldı. Öncelikle bu sistem HEK293T hücrelerinde optimize edildi. Bu şekilde, promotörde C-146T mutasyonu içeren genomu modifıye edilmiş klonlar küçük delesyon mutasyonlarıyla beraber elde edildi. İkinci olarak, bu sistem hepatik organoidlerde denendi. Hepatik organoitlerin CRISPR-Cas9 ile kimyasal ve fiziksel bazlı transfeksiyon ajanları yoluyla transfeksiyonu farklı verimlilikler göstermiştir. Düşük transfeksiyon verimi, hepatik organoidlerde hTERT promoterini düzenlemek için engel oluşturmaktadır. Bu nedenle, organoidlerde daha yüksek transfeksiyon etkinliği elde etmek için daha fazla optimizasyon yapılması önemlidir. Bunlara ek olarak, TP53 genini hepatik organoidlerde benzer bir yaklaşımla nakavt edilmeye çalışılmıştır. Hepatik organoidlerin transfeksiyonu ve düzenlenmesi, CRISPR-Cas9 sisteminin hepatik organoidlerde çalıştığını ve izojenik organoid klonlarının elde edilebileceğini göstermiştir. | |||
| Human TERT (hTERT) promoter mutations, C-124T and C-146T are the most common genetic alterations in hepatocellular carcinoma, has an early stage in hepatocarcinogenesis, and associate with the progression. Mechanism of TERT promotor mutations which collaborates with carcinogenesis is not well explained yet. In this study, we generated a hepatic organoid (eHEPO) culture system using human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived EpCAM-positive endodermal cells as an intermediate. eHEPOs can be produced within 2 weeks and expanded long term without any loss of differentiation capacity to mature hepatocytes. In this study, we aimed to introduce hTERT promoter mutations in hepatic organoids using CRISPR- Cas9 based genome editing. For the editing of TERT promoter, a homology-directed repair (HDR) based CRISPR Cas9 system called “pop in pop out” strategy was used. This system was optimized in HEK293T cells. Genome modified clones which included C-146T mutation in the promoter were obtained with small deletion mutations. We tried to utilize this system in hepatic organoids. Transfection of the hepatic organoids with CRISPR-Cas9 via chemical and physical-based transfection agents displayed different efficiencies. Low transfection efficiency hampers to edit promoter of hTERT in hepatic organoids. Therefore, to obtain higher transfection efficiency in organoids further, optimization is critical. Also, we tried to knockout the TP53 gene in hepatic organoids with a similar approach. Transfection and editing of hepatic organoids exhibited that the CRISPR-Cas9 system works in hepatic organoids and isogenic organoids clones can be obtained. | |||