| Tez Künye | Durumu | ||
| Cloning and expression of membrane-bound FtsH protease of Geobacillus kaustophilus in escherichia coli / Membran bağlı FtsH proteazın Geobacillus kaustophilus`dan escherichia coli`de klonlaması ve ekspresyonu Yazar:SALIM SAIM RAMADHANI Danışman: YRD. DOÇ. DR. FATMA İNCİ ÖZDEMİR Yer Bilgisi: Gebze Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Konu:Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2016 98 s. | ||
| Hem ökaryotik hem prokaryotik hücrelerde, protein yıkımı Lon, FtsH, ClpAP, ClpXP and HslUV gibi ATP-bağımlı proteazlar aracılığı ile gerçekleştirilmektedir. Membran bağlı bir çinko metalloproteaz olan FtsH, hem sitoplazmik proteinleri hem de integral membran proteinlerini yıkıma uğratabilme özelliği ile ATP-bağımlı bir proteazlar arasında önemli bir yere sahiptir. FtsH, sitoplazmik membranı 2 kez geçmektedir ve ATP bağlı domaini içeren büyük sitoplazmik C-terminal domaine sahiptir. Daha önceki çalışmada, Geobacillus kaustophilus FtsH’ın proteolitik aktivitisini çalışmak için, proteazın transmembran domainine sahip olmayan 1530 bp’lik ftsH gen segmenti klonlanmıştır. Ancak, hiçbir protein ekspresyonu gözlemlenmemiştir. Bu çalışmada, tüm G.k-ftsH geni E. coli BL21 (DE3)’de başarıyla klonlanmıştır ve N-terminal transmembran domainine sahip olmayan protein tekrar ekspres edilmiş ve saflaştırılmıştır. Saflaştırılmış proteinin moleküler ağırlığı SDS-PAGE ve Western Blotlama yöntemleriyle yaklaşık 58 kDa olarak belirlenmiştir. Saflaştırılmış proteaz 4 mM ATP varlığında α-kazeini başlangıç konsantrasyonunun % 96-98 oranında yıkıma uğratmıştır. G.k-FtsH ATPaz aktivitesi için optimum sıcaklık 55°C olarak belirlenmiştir ve 55-60°C’de yarım-saatlik inkübasyonu sonunda enzim aktivitesinin % 60’ını koruduğu gözlemlenmiştir. G.k-FtsH proteaz, ATPaz aktivitisi için hem ATP hem de Mg2+ ‘ye gereksinim duymaktadır, 3,4 U/µL. Ayrıca enzim etkin bir şekilde CTP (3,8 U/µL) ve zayıf bir şekilde GTP’ yi (2 U/µL) hidrolize etmekte, ancak UTP ve ADP’ yi hidrolize edememektedir. G.k-FtsH ATPaz aktivitisi 10 mM EDTA ve O-phenanthroline metal kelatlayıcı ajanlar ile sırasıyla % 65 ve % 48 oranında inhibe edilmiştir ve bununla birlikte 1 mM lactacystin ve phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ile sırasıyla % 45 ve % 57 oranında inhibe edilmiştir. Bu sonuçlar, N-terminal transmembran domainine sahip olmayan G.k-FtsH’ın etkin bir şekilde eksprese edildiğini ve ATPaz ve proteaz aktivitesi gösterdiğini belirlemiştir. | |||
| In both eukaryotic and prokaryotic cells, protein degradation is largely conducted by ATP-dependent proteases such as Lon, FtsH, ClpAP, ClpXP and HslUV. Among these proteases, FtsH is unique as a membrane-bound ATP-dependent zinc-metalloprotease that degrades integral membrane proteins as well as cytoplasmic proteins. It spans the cytoplasmic membrane twice and has a large cytoplasmic C-terminal with a putative ATP binding domain. To study the proteolytic activity of Geobacillus kaustophilus FtsH, we previously cloned a 1530 bp ftsH gene segment which did not include the transmembrane segment of the protease. However, we did not observe any protein expression. In this study we have successfully cloned the full-length G.k-ftsH gene in E. coli BL21 (DE3) host cells and expressed and purified again N-terminal transmembrane domain lacking FtsH. The molecular weight of purified His6-tagged G.k-FtsH was determined by SDS-PAGE and Western Blotting as ~58 kDa. Purified G.k-FtsH efficiently degraded α-casein in the presence of 4 mM ATP at up to 96-98% of the starting concentration. Optimum temperature of G.k-FtsH ATPase activity was observed at 55°C and the enzyme retained 60% activity after half-hour incubation at 55-60°C. G.k-FtsH protease requires both ATP and Mg2+ for its ATPase activity, 3.4 U/µL. The enzyme is also capable of hydrolyzing CTP (3.8 U/µL) and slightly GTP (2 U/µL) but not UTP and ADP. ATPase activity of G.k-FtsH is inhibited by 10 mM metal-chelating agents EDTA and O-phenanthroline, 65% and 48% respectively and also markedly inhibited in the presence of 1 mM lactacystin (45%) and phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) (57%). These results showed the successful expression of G.k-FtsH without N-terminal transmembrane domain and characterized its ATPase activity and protease activity efficiently. | |||