| Tez Künye | Durumu | ||
| The development of prophylactic and therapeutic vaccine using cell derived extracellular vesicles / Hücre kökenli hücre dışı kesecikler kullanılarak profilaktik ve terapötik aşı geliştirilmesi Yazar:MUZAFFER YILDIRIM Danışman: PROF. DR. İHSAN GÜRSEL Yer Bilgisi: İhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Genetik = Genetics Dizin: | Onaylandı Doktora İngilizce 2022 166 s. | ||
| Bu tezin temel amacı, kanser tedavisine karşı profilaktik ve terapötik bir taşıyıcı olarak, dıştan yüklenmiş olan hücre hattından ve tümör hattından üretilmiş eksozomların in vivo uygulanabilirliğinin genişletilmesidir. 30 ila 150 nm arasında bir boyuta sahip eksozomlar, her tür memeli hücresi tarafından salgılanan küçük hücre dışı keseciklerdir. Eksozomlar lipidler, nükleik asitler, metabolitler ve proteinler gibi biyoaktif kargoları aracılığıyla yeni bir hücreler arası iletişim moduna aracılık ederler. Eksozomlar, doğal dağıtım yeteneklerini kullanarak kanser tedavisinde immün terapötik nano taşıyıcılar olarak başarılı bir şekilde hizmet etmektedirler. Ayrıca, eksozomlar dolaşımdaki kararlılıkları, biyouyumlulukları ve düşük toksisiteleri nedeniyle bir dağıtım sistemi olarak ilgi çekicidirler. Bu tezin ilk bölümünde, terapötik bir murin melanom kanser aşısı geliştirmek için eksozomları bir nano taşıyıcı sistem olarak kullandık. Eksozomları CpG ODN, model antijen OVA ve lipidik ligand alfa-galaktosilseramid (aGC) ile liyofilizasyon yöntemi sayesinde başarıyla yükledik. Liyofilizasyonun hücre hattından üretilmiş eksozomlar üzerindeki etkisini akış sitometrisi, qNano, taramalı elektron mikroskobu ve western blot yöntemi ile analiz ettik. Liyofilizasyonun eksozomların veziküller bütünlüğüne ve temel biyolojik özelliklerine zarar vermediğini bulduk. Ayrıca, fare PEC, mezenterik lenf düğümü ve dalak hücrelerinde yüklenmiş eksozomların biyolojik dağılımını ve bağışıklık hücrelerini aktive etme kapasitesini test ettik. Yüklü eksozomların çoğunlukla antijen sunan hücreler (APC) tarafından alındığını gösterdik. Ayrıca, CpG ODN’nin eksozomlara yüklenmesinin makrofajlarda, B hücrelerinde ve dendritik hücreler’ de (DC) APC aktivasyon belirteçlerini önemli ölçüde artırdığını ve fare mezenterik lenf düğümü ve splenositlerinden önemli ölçüde IFNy üretimini indüklediğini gösterdik. Son olarak, B16F10-OVA melanom tümörü taşıyan farelerde, CpG ODN, OVA ve aGC yüklü eksozomların terapötik etkisini test ettik. Üçlü (CpG ODN, OVA ve aGC) ligand yüklü eksozomlarla terapötik aşılamanın, farelerde yerleşik melanom tümörlerinin ilerlemesini baskıladığını bulduk. Ayrıca, üçlü ligand yüklü eksozomlar, Th-1 destekli anti-IgG OVA bağışıklığını tetikledi ve tümör mikro çevresindeki bağışıklık hücrelerini tümör baskılayıcı fenotipe dönüştürdü. Bu tezin ikinci bölümünde, immün terapötik bir kanser aşısı olarak tümör kaynaklı eksozomlar (TEX’ler) kullandık. Bu hücre dışı kesecikler doğal zengin tümör antijen rezervuarlarına sahiptir. Zayıf veya sınırlı bağışıklık oluşturma gibi istenmeyen özellikleri ve tümör hücreleri arasındaki iletişime aracılık ederek kanser gelişimini kolaylaştırması nedeniyle, TEX’ler güçlü hümoral ve hücre aracılı tümöre özgü bağışıklık tepkisini başlatan etkili bir immün adjuvan dağıtım sistemine dönüştürülebilir. Bu çalışmada, 4T1/Her2 hücre kökenli eksozomlar iki güçlü immün adjuvan CpG ODN ve p(I:C) ile yüklendikten sonra bu eksozomların bağışıklık oluşturma kapasitelerini değerlendirdik. Her iki ligand ile yüklenmiş TEX’ler antijene özgü birincil ve bellek T hücresi yanıtlarını aktive etti ve güçlendirilmiş immün sistemi uyarıcı özellikler gösterdi. Ayrıca, eksozom bazlı aşı adayımız, yüksek IgG2a ve IFNγ salgılayarak güçlü Th1-destekli bağışıklık ortaya çıkardı. CpG ODN ve p(I:C) yüklü 4T1 tümör kökenli eksozomların meme kanseri modelinde terapötik olarak farelere uygulanmasının, 4T1 tümör taşıyan farelerde tümör büyümesini gerilediğini bulduk. Sonuç olarak, bu çalışma, eksozom bazlı bir terapötik aşının, yerleşik tümörleri tersine çevirmek için yeterli olan güçlü hücresel ve hümoral anti-tümör bağışıklığını desteklediğini ortaya koydu. Bu tezin son bölümünde, süper paramanyetik demir oksit nanopartiküller (SPION) ve immün sistemi uyarıcı ligandlarla yüklü hücre hattından üretilmiş eksozomların terapötik potansiyelini inceledik. Öncelikle, SPION yüklemesinin eksozomların bağışıklık hücreleri tarafından alınımını arttırdığını gösterdik. Ayrıca, SPION ve CpG ODN yüklü eksozomlarla inkübe edilen dalak hücrelerinin, önemli ölçüde yüksek IL-12 ve IFNy indüklediğini bulduk. Son olarak, atimik farelerde oluşturulan insan hepatoselüler karsinom tümör modelinde eksozomal aşı adayımızı test ettik. SPION, TLR3 ve TLR9 ligandları ile yüklenmiş eksozomlar doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunu indükledi. Ayrıca, hepatoselüler karsinom tümör oluşturan atimik farelerde tümörlerin gerilediği ve tedavi edilen farelerin hayatta kalma oranını artırdığını gösterdik. | |||
| The primary aim of this thesis is to extend the breadth of in vivo application of externally loaded cell-line derived and tumor derived exosomes as a prophylactic and therapeutic carrier against cancer treatment. Exosomes with a size between 30 to 150 nm are small extracellular vesicles secreted by all types of mammalian cells. They mediate a novel mode of intercellular communication through their bioactive cargos such as lipids, nucleic acids, metabolites, and proteins, which can be delivered to the target cells. Exosomes have successfully served as immunotherapeutic nanocarriers in cancer treatment using their natural delivery capabilities. Furthermore, they are attractive as a delivery system because of their stability in circulation, biocompatibility, and low toxicity. In the first part of this thesis, we used exosomes as a nanocarrier system to develop cancer vaccines in a therapeutic murine melanoma cancer treatment. We show that lyophilization of exosomes together with the CpG ODN, model antigen OVA and lipidic ligand alpha-galactosylceramide (αGC) followed by controlled reconstitution is successfully accomplished. We analyzed the effect of the lyophilization on a cell line-derived exosomes and we characterized the exosomes by using bead-based technique via flow cytometry, qNano, Scaning electron microscopy, and western blotting. We showed that lyophilization does not harm exosomes’ vesicular integrity and fundamental biological features. Furthermore, we tested the biodistribution and activating capacity of encapsulated exosomes in mouse PEC, mesenteric lymph node, and spleen cells. We found out that loaded exosomes are mostly taken up by antigen-presenting cells. Also, we showed that loading CpG ODN into exosomes significantly improves APC activation markers in macrophages, B cells, and DCs and induced significantly higher IFNγ production from mouse mLN and splenocytes. Finally, we tested the therapeutic utility of the CpG ODN, OVA and αGC encapsulating exosome in the B16F10-OVA melanoma tumor-bearing mice. We found out that therapeutic vaccination with triple (CpG ODN, OVA, and αGC) ligand encapsulating exosomes suppressed the progression of established melanoma tumors in mice. Moreover, our triple ligand loaded exosomes triggered Th-1 biased anti-IgG OVA immunity and converted immune cells in tumor microenvironment to the tumor-suppressing phenotype. In the second part of this thesis, we used tumor-derived exosomes (TEXs) as an immunotherapeutic cancer vaccine. These nanovesicles are inherently possesses rich tumor antigen reservoirs. Due to their undesirable features such as poor or limited immunogenicity as well as facilitation of cancer development via mediating communication between tumor cells, TEXs could be transformed into an effective immune adjuvant delivery system that initiates a strong humoral and cell-mediated tumor-specific immune response. In this study, we evaluated to immunogenicity of 4T1/Her2 cell-derived exosomes upon loading them with two potent immuno adjuvant, a TLR9 ligand, K-type CpG ODN and a TLR3 ligand, p(I:C). We showed that engineered TEXs co-encapsulating both ligands displayed boosted immunostimulatory properties by activating antigen-specific primary and memory T cell responses. Furthermore, our exosome-based vaccine candidate elicited robust Th1-biased immunity as evidenced by elevated secretion of IgG2a and IFNγ. In a therapeutic breast cancer model, we found out that administration of 4T1 tumor derived exosomes loaded with CpG ODN and p(I:C) to animals regressed tumor growth in 4T1 tumor-bearing mice. As a result, this work implicated that an exosome based therapeutic vaccine promoted strong cellular and humoral anti-tumor immunity that is sufficient to reverse established tumors. The last part of this thesis, we studied the therapeutic potential of cell line-derived exosomes loaded with superparamagnetic iron oxide nanoparticles(SPION) and immunostimulatory ligands. We showed that loading SPION enhanced the in vitro delivery of exosomes within immune cells. Also, we found out that spleen cells incubated with exosomes encapsulating with SPION and CpG ODN induced significantly higher levels of IL-12 and IFNγ. Finally, we tested our exosomal vaccine candidate in human hepatocellular carcinoma tumor model in athymic mice. We showed that TLR3 and TLR9 ligands encapsulated with SPION loaded exosomes induced pronounced innate immune activation and regressed tumors and improve survival rate of treated mice. | |||