| Tez Künye | Durumu | ||
| Engineering of citrate synthase from thermoplasma acidophilum to investigate the molecular mechanisms of thermostability / Thermoplasma acidophilum sitrat sentaz enziminde thermal stabilitenin moleküler mekanizmasının protein mühendisliği yöntemi ile araştırılması Yazar:İPEK ERDURAN Danışman: PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK Yer Bilgisi: Orta Doğu Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology Dizin:Enzimler = Enzymes ; Mutasyon = Mutation ; Protein mühendisliği = Protein engineering ; Proteinler = Proteins ; Sitrat sentez = Sitrat synthase ; Thermoplasma acidophilum = Thermoplasma acidophilum | Onaylandı Doktora İngilizce 2000 249 s. | ||
| oz THERMOPLASMA ACIDOPHILUM SİTRAT SENTAZ ENZİMİNDE TERMAL STABİLİTENİN MOLEKÜLER MEKANİZMASININ PROTEİN MÜHENDİSLİĞİ YÖNTEMİ İLE ARAŞTI RILI MASI Erduran, İpek Doktora, Biyoloji Bölümü Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Semra Kocabıyık Ocak 2000, 223 sayfa Bu çalışmada, proteinlerde yüksek sıcaklığa dayanıklılığın moleküler mekanizmasını araştırmak için sitrat sentaz enzimini model sistem olarak seçtik. Mezofilik domuz kalbi (optimum sıcaklığı 37°C), termofilik Thermoplasma (Tp.) acidophilum (optimum sıcaklığı 55°C) ve hipertermofılik Pyrococcus furiosus’öan {Pf.) (optimum sıcaklığı 100°C) elde edilen bu temel metabolizma enziminin yapısal karşılaştırması, yüksek sıcaklıklarda optimum aktivite için gerekli olan stabilite özelliklerinin anlaşılmasına katkıda bulunabilecek farklılıkları açığa çıkarmıştır. Çalışmalarımızda bu farklılıklar arasından iki spesifik yapısal özellik üzerinde odaklandık: Tp. sitrat sentaz enziminin monomer-monomer etkileşim yüzeyindeki hidrofobik kuvvetlerin oranındaki artış, ve enzimin yapısında bulunan iç oyukların her iki Archaeal sitrat sentaz enzimininde de hacimce ve sayıca azalması sonucunda bu enzimlerin daha kompakt bir yapıda olması. Tp. sitrat sentaz enziminin dimer interfazındaki hidrofobik kuvvetlerin etkisini araştırmak için interfazda bulunan helixlerde, her bir mutasyon için tek nükleotid değişikliği yaparak, dört farklı mutasyon gerçekleştirilmiştir: Ala 97->Ser, Ala 104->Thr, Giy 196-»Val ve Giy VI209->Ala. Tp. sitrat sentaz enziminin yapısında bulunan iç oyuklardan seçtiğimiz iki tanesini doldurmak amacıyla, sırasıyla tek ve üç nükleotid değişikliği ile, Ser 343^-Thr ve Thr 436->Tyr dönüşümü yapılmıştır. Mutant proteinler, Tp. sitrat sentaz enzimi için E-co/Z’de kurulmuş olan bölgeye özel mutasyon sistemi kullanılarak bir pBS(+)phagemid vektörü ile elde edilmiştir. Tüm mutasyonlar dideoksi-nükleik asit dizi analizi ile doğrulanmış ve mutant proteinler E.coli XL-1 Blue ya da TG-1 susunda ekspres edilmiştir. Mutant olmayan ve mutant enzimler afinite kolon kromatografisi yöntemi ile Reactive Red 120 kolunu kullanılarak saf olarak elde edilmiş, ve her bir mutasyonun enzimin kinetik özellikleri, kimyasal ve thermal stabilitesi üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Ala 97-^-Ser, Ala 104->Thr ve Giy 209->Ala mutasyonları Tp. sitrat sentaz enziminin termal stabilitesini arttırmış, katalitik özelliklerini de geliştirmiştir. Ala 97^>Ser ve Ala 104->Thr değişiklikleri ile yerleştirilen yeni hidrofilik gruplar, hidrofobik bölgede hem tolere edilebilmiş, hem de stabiliteyi arttırmıştır. Ser ve Thr yan gruplarının Ala yan grubuna göre daha büyük olması, dimer interfazında çok yakın paketlenmeyi sağladığı düşünülmektedir. Ayrıca bu grupların yeni hidrojen bağları kurarak aktif dimerin stabilitesini de etkilemesi olasıdır. Giy 209->Ala mutasyonu katlanmamış formdaki entropiyi azaltarak ve/veya dimer etkileşim yüzeyinde hidrofobisiteyi arttırarak a-helix yapıyı dayanıklı hale getirmiş, böylece termal stabiliteyi arttırmış olabileceği düşünülmektedir. Diğer taraftan, Giy 196^-Val mutasyonu ise Tp. sitrat sentaz enziminin hem katalitik aktivitesini hem de stabilitesini belirgin olarak azaltmıştır. Valin amino asitinin büyük yan grubu dolayısıyla yapıyı bozma eğiliminin, stabiliteyi arttırabilecek olası hidrofobik etkisini azalttığı düşünülmektedir. Sonuç olarak, protein alt ünite yüzeyinde monomer-monomer etkileşiminin sıkılaştırılması, orjinal thermal stabil enzimlerin dahi protein thermal stabilitesini arttırabilecek uygun bir yöntemdir. vii ^ffliL.. ‘ jk ‘ ? KiTp. sitrat sentaz enzimin iç oyuklarını doldurmak için yapılan her iki mutasyonda aktiviteyi dikkate değer oranda azaltmıştır. Bu sonuçlarda stabiliteyi arttırmak için bu yöntem kullanıldığında yapıyı bozabilecek hacimsel değişikleri engellemek için, planlanan amino asit dönüşümlerinin pozisyon ve tipinin önemini göstermektedir. Anahtar kelimeler: Thermoplasma acidophilum, sitrat sentaz, termal stabilite, bölgeye özel mutasyon. vuı | |||
| ABSTRACT ENGINEERING OF CITRATE SYNTHASE FROM THERMOPLASMA ACIDOPHILUM TO INVESTIGATE THE MOLECULAR MECHANISMS OF THERMOSTABILITY Erduran, İpek Ph.D., Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Semra Kocabıyık January 2000, 223 pages We have chosen citrate synthase (CS) as a model enzyme for an investigation into molecular basis of protein thermostability. Structural comparison of this central metabolic enzyme from mesophile pig heart (optimum temperature 37°C), moderately thermophile Thermoplasma (Tp.) acidophilum (optimum temperature 55°C) and hyperthermophile Pyrococcus furiosus (Pf.) (optimum temperature 100°C) revealed differences that may contribute insights into the stabilizing features necessary for optimal activity under elevated temperatures. In our studies, we have focused on two of these specific structural features: the increased hydrophobic interactions in the subunit interface of TpCS, and increased compactness of the thermostable Archaeal citrate synthase as a result of decreased size and number of internal cavities. In order to test the contribution of hydrophobic interactions in the dimer interface four mutations in the interface helices were constructed by single nucleotide changes: Ala 97^Ser, Ala 104^Thr, Gly 196->Val and Gly 209-»Ala replacements. In order to fill two selected cavities in the structure of 111TpCS Ser 343 to Thr and Thr 346 to Tyr exchanges were made, with single and triple nucleotide substitutions, respectively. The mutant proteins were constructed by using a site-specific mutagenesis system prepared for TpCS in E.coli using a pBS(+) phagemid vector. All mutations were confirmed by dideoxy-DNA sequencing and mutant proteins were expressed in E.coli XL-1 Blue or TG-1 strains. The wild-type and mutant enzymes were purified to homogeneity using affinity chromatography on Reactive Red 120 column, and the effects of each mutation on the kinetic properties, and chemical and temperature stability of citrate synthase were investigated. Our results showed that three substitutions, Ala 97^-Ser, Ala 104H>Thr and Gly 209-»Ala enhanced the thermostability of the Tp. citrate synthase while improving the catalytic properties of the enzyme. The newly introduced hydrophilic residues as the result of Ala 97^Ser and Ala 104-^Thr mutations could not only be tolerated in the hydrophobic core but also stabilized the enzyme. This could be related to more intimate packing of the dimer interface with bulky side chains of Ser and Thr relative to Ala. Also, these residues could provide new hydrogen bonding interactions which stabilize the active dimer. The Gly 209-»Ala substitution should decrease the entropy of unfolded state and/or increase the hydrophobicity in the subunit interface, thus stabilize the a- helix and improve the thermostability of citrate synthase. Increased thermal stability accomplished by Gly 209 substitution by Ala, could also be regarded as a result of the high intrinsic a-helix tendency of Ala which favors helix stability. On the other hand, Gly 196^Val mutation significantly reduced the catalytic activity, as well as the stability of TpCS enzyme. The tertiary and secondary effects of valine 196 substitution might diminish a possible hydrophobicity effect that it could otherwise impose in the favor of increasing stability. As a result, the engineering protein subunit interface to enhance monomer-monomer interactions could provide ample opportunity for IVimprovement of protein thermostability, even that of the originally thermostable enzymes. The cavity filling mutations have remarkably lowered the activity of the TpCS enzyme, which clearly reflects the importance of the positions and the types of substituting amino acids in order to prevent any volume interference that will destabilize the structure when this stabilizing strategy is used. Key words: Thermoplasma acidophilum, citrate synthase, thermostability, site-specific mutagenesis. | |||