| Tez Künye | Durumu | ||
| Development and immunological evaluation of SARS-CoV-2 virus-like particles (VLP) expressing the prefusion stabilized variants of the spike protein / Prefüzyon stabilize Spike proteini varyantlarını taşıyan SARS-CoV-2 virüs benzeri parçacıkların geliştirilmesi ve immünolojik değerlendirilmesi̇ Yazar:EMRE MERT İPEKOĞLU Danışman: PROF. DR. MAYDA GÜRSEL Yer Bilgisi: Orta Doğu Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Konu:Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Biyoloji = Biology ; Moleküler Tıp = Molecular Medicine Dizin:Aşılar = Vaccines ; COVID 19 = COVID 19 ; SARS virüsü = SARS virus | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2022 147 s. | ||
| Coronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19), 2019’un sonlarında Çin’in Wuhan kentinde ortaya çıkmıştır ve nedensel ajanı Şiddetli Akut Solunum Sendromu Coronavirüs 2 (SARS-CoV-2) olarak tanımlanmıştır. Bu son derece bulaşıcı virüs, COVID-19 pandemisine yol açan yeni bir pnömoni salgınına neden olmuştur. COVID-19 pandemisinin ortaya çıkması, SARS-CoV-2’ye karşı etkili bir aşıya acilen ihtiyaç duyulmasına sebebiyet vermiştir. SARS-CoV-2’ye karşı bir aşı adayı üretmek için etkili bir strateji, SARS-CoV-2’nin yapısal proteinlerinin (Spike, Membran, Zarf ve Nükleokapsid proteinlerinin) kendi kendine bir araya gelme özelliğinin kullanılarak Virüs benzeri partikülleri (VLP) oluşturmasına dayanmaktadır. İlk çalışmalarımız, memeli konakçı hücre ifadesi için virüsün dört yapısal proteinini kodlayan genlerinin transfeksiyonu yoluyla memeli hücresinden üretilen immünojenik SARS-CoV-2 VLP’lerin laboratuvar ölçeğinde üretimine odaklanmıştır. Burada, prefüzyon stabilize (2p) veya termostabil altı prolin (6p; HexaPro) Spike proteinini barındıran SARS-CoV-2 VLP’lerin ölçeklenebilir üretimi ve saflaştırılması için bir süreç geliştirme çerçevesi açıkladık. Sonuçlarımız, süspansiyon kültüre adapte edilmiş vii HEK hücrelerinin, çok-modlu kromatografi ve teğetsel akış filtrasyonu gibi ölçeklenebilir saflaştırma tekniklerinin uygulanmasının ardından, otantik SARS- CoV-2 virionlarına benzer boyutlarda dört yapısal proteini içeren VLP’ler üretebildiğini göstermiştir. Bu çalışmada ayrıca, farelerde VLP’nin ortaya çıkardığı anti-Spike immünoglobulinlerini izlemek ve serolojik testler yapmak için SARS-CoV-2’nin 6x histidin etiketli rekombinant Spike (6p) proteinini ürettik ve afinite saflaştırması yöntemi ile elde ettik. Sonuçlarımız, ELISA deneylerinin tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu açısından, Spike proteininin saflaştırılması için uyarlanmış güncel bir protokolün, salgılanan rekombinant proteinler için kullanılan geleneksel afinite saflaştırma tekniklerinden üstün olduğunu göstermiştir. Son olarak, K3 CpG ODN ve/veya Alum içeren aşı adjuvanları ile kombinasyon halinde, 2p ve 6p Spike proteinlerini barındıran VLP’lerin bağışıklık koruyucu potansiyelini inceledik. Toplu sonuçlarımız Alum tarafından adsorbe edilmiş, K3 CpG ile adjuvanlanmış yüksek doz 6p VLP’lerin, adjuvanlanmamış, düşük doz veya 2p VLP karşıtlarına kıyasla aşılanmış BALB/c farelerde güçlü hümoral ve hücresel bağışıklık tepkileri ortaya çıkardığını ve SARS-CoV-2’ye karşı bir etkili aşı adayı olabileceğini ortaya koyarken, aynı zamanda bu aşı adayının insan klinik deneylerinde değerlendirilmesi için bir gerekçe sağlamaktadır | |||
| Emergence of the COVID-19 pandemic necessitated rapid development of highly effective vaccines against SARS-CoV-2. One adaptable strategy to produce a vaccine candidate against SARS-CoV-2 is based on the exploitation of the self- assembly feature of the structural proteins of SARS-CoV-2: Spike, Membrane, Envelope and Nucleocapsid, forming Virus-like particles (VLP). Our early studies focused on laboratory-scale production of SARS-CoV-2 VLPs in a mammalian host cell system based on transient expression of viral proteins. Herein, we describe a process development framework for scalable production and purification of SARS- CoV-2 VLPs expressing either the prefusion stabilized (2p) or the thermostable six proline (6p; HexaPro) stabilized Spike proteins. Results showed that suspension culture-adapted HEK 293 cells were able to produce vesicular VLPs that were similar in size to the authentic SARS-CoV-2 virions. Combined use of multimodal chromatography, nucleic acid removal through Denarase treatment and tangential flow filtration,enabled large-scale production of the SARS-CoV-2 VLPs. v In this study, we also produced and affinity purified 6x histidine-tagged recombinant Spike (6p) protein of SARS-CoV-2 to conduct in-house serological assays to monitor VLP vaccine-induced anti-Spike immunoglobulin response in immunized mice. Our results demonstrated that a modified purification protocol was superior to conventional affinity purification technique for the production of the secreted recombinant protein in terms of reproducibility and standardization of ELISA experiments. Finally, we examined the immunogenicity of 2p and 6p Spike harbouring VLPs combined with vaccine adjuvants K3 CpG ODN and/or Alum. Collectively, our results suggest that Alum adsorbed, K3 CpG adjuvanted high dose 6p VLPs elicited robust humoral and cellular immune responses in vaccinated BALB/c mice as compared to non-adjuvanted, low dose or 2p VLP counterparts, proving the effectiveness of this formulation as a vaccine candidate against SARS-CoV-2. | |||