| Tez Künye | Durumu | ||
| ATR-FTIR evaluation of structural and functional changes on murine macrophage cells upon activation and suppression by immunotherapeutic oligodeoxynucleotides / Baskılayan ve uyaran iki tip immünoterapötik oligodeoksinükleotidlerin immunolojik hücrelerde yol açtıgı yapısal ve fonksiyonel değişimlerin ATR-FTIR metodu ile değerlendirmesi Yazar:EMRULLA SPAHİU Danışman: PROF. DR. FERİDE SEVERCAN ; DOÇ. DR. MAYDA GÜRSEL Yer Bilgisi: Orta Doğu Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı Konu:Biyofizik = Biophysics ; Biyoloji = Biology Dizin:Kızılötesi spektroskopi = Infrared spectroscopy | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2015 112 s. | ||
| Bu çalışmada, ATR-FTIR metodu ile baskılayan ve uyaran iki tip immünoterapötik oligodeoksinükleotitlerin, makrofaj hücrelerinde yol açtıkları yapısal ve fonksiyonel değişimlerin değerlendirilmesi yapılmıştır. Makrofaj hücreleri, bağışıklık sisteminde anahtar rol oynamaktadır. Sahip olduklari yüksek fleksibilite ile çevresel sinyallere kolayca alışabılen hücrelerdir. Bu anlamda mükemmel bir şekilde fiziyolojik degişikliklere mağruz kalabilme özelliğine sahiptirler. IR spektrumunda geniş çapta moleküler sinyaller verdiğinden dolayı, ATR-FTIR başarılı bir şekilde kullanılabilir. LPS ve CpG ODN bağışıklık sistemini hızlıca arttirabilirler ve çok etkili pro-enflamatuar sitokin, kemokin ve spesifik Ig ajanları üretirler. CpG ODN immünoterapötik bir ilaç aktivitesi gösterebildigi aciklanmistir. Ancak son zamanlarda çıkan klinik çalışmalarda, CpG’nin bazı ciddi sorunları beraberinde getirdiği gözlenmiştir, ki bunlardan bazıları alerji, toksik şok hatta organizmanın ölümüne kadar götürmektedir. CpG ODN ile sürdürülen makrofajlardaki bu aktivasyonun yan etkilerini durdurma ihtiyacı, baskılayıcı ODN’lerin bulunmasına yol açtmıstır, ki bunlardan birisi de A151 ODN’dir. A151 ODN’in çalısma mekanizması bilinmemektedir. Bu çalışmada, fare makrofaj RAW 264.7 hücreleri, PBS, CpG ODN, LPS, baskılayıcı ODNA151, ve ters K3-ODN tretmanları ile dört değisik zaman dilimlerinde aşılanmıştır. Homojen 2∙〖10〗^6/μL konsantrasyonlu hücre örnekleri hazırlanip üç replikada n=5 olmak üzere FTIR spektraları elde edilmiştir. Smoothing, baseline correction ve normalization adımlarından sonra spektralar kuantitativ incelemelere hazır olmuştur. Normal dağılımlı sonuçlar One-Way ANOVA ve Dunnet’s test for multiple comparisons ile analizi yapılmıştır, normal dağılımı olmayan örnekler ise Kruskal–Wallis with Dunn’s test for multiple comparisons ile incelenmiştir. Tüm sonuçlar ortalama±SEM olarak sunulmuştur. Sonuçlar, uyarıcı CpG ODN’nin IR spektrumunda yüksek değisimlere yol açtığı gözlenmiştir. Iki saate kadar ki zaman dilimlerinde, CpG ODN ve LPS, RNA sentezinin bariz bir şekilde arttığı gözlenmiştir. 6 saatten sonra ki zaman dilimlerinde, DNA sentezi/değisikliği başladiği bulunmuştur. LPS, anti-proleferativ bir ajan olduğu için, 6 saatten sonra, DNA sentezi yapmamıştır. Stimulasyon ajanlarının kullanıldığı örneklerde, protein seviyelerinin düştüğü bulunmuştur, ki bu aktivasyona bağli oksidantların oksidatif stres uygulamalari ile bağdaşmıstır. Bu etkileri düşürmek için, hücre içi proteozomlarin proteinleri degrade ettikleri bulunmuştur. Aktivasyona bağlı, membran akişkanlığında artiş gözlenmiştir, ki bu doymamis yağlarin düşüşü ile, artan lipid peroksidasyonu ile ve düsen kolesterol miktarlari ile doğru orantida olduğu belirlenmiştir. Son olarak, bu değişimlerin sinyalizasyon mekanizmalarinda, iyon geçirgenliğinde ve birçok membranlara bağlı hücre fonksiyonlarında değişimlere meydan açabilecegine sonuç bağlanmıştır. Anahatar Kelimeler: Makrofaj, CpG ODN, A151 ODN, FTIR spektroskopisi | |||
| In the present study, ATR-FTIR was used to examine the structural and functional changes on murine macrophage cells upon activation and suppression by immunotherapeutic ODNs. Macrophage cells play a key role in innate and adaptive immunity. Their possession of high flexibility helps them to successfully respond to environmental signals. In this context, they can impressively alter their physiology in relation to their function and these changes have large molecular signals in the infrared spectral region that can be traced with FTIR spectroscopy. LPS and CpG ODN are used as well-known stimulants of macrophages to produce the powerful pro-inflammatory agents such as cytokines, chemokines and highly specific Ig’s. CpG ODN is potentially used in many immunotherapeutic therapies, but is found to cause allergy, toxic shock and death. The need for a suppressive agent led to the innovation of suppressive ODN, whose mechanism is not elucidated. In the present study, murine macrophage-like RAW 264.7 cells are treated with PBS medium, CpG ODN, LPS, suppressive ODNA151, and K3 Flip-ODN in four different time scales, to monitor the changes on the course of time. Homogenous 2∙〖10〗^6/μL cell samples were prepared and FTIR spectra were recorded in triplicates. In total n=5 was performed. The spectra recorded underwent smoothing, baseline correction and normalization steps, and quantitative analysis was performed. One way-ANOVA with Dunnet’s test for multiple comparisons and Kruskal–Wallis with Dunn’s test for multiple comparisons was used for the analysis of normally and non-normally distributed data, respectively. All results were expressed as mean±SEM. The results clearly indicate that CpG-induced macrophage cells show prominent features in their IR spectra for their activation. The time period till 2h of stimulation seems to be the period of extensive RNA synthesis, and as it ceases, DNA synthesis starts from the 6th hour of stimulation upon both CpG ODN and LPS stimulation, except LPS at 6 hours, due to the property of LPS being an anti-proliferative agent. It is also found that stimulation of macrophage cells with CpG ODN and LPS decreases protein content. This is explained by the production of numerous oxidants, causing oxidative stress and in intention of protecting the cell; proteasomes start the degradation of oxidized proteins. The membrane fluidity increases during activation with CpG ODN and LPS, as a result of decreased unsaturated lipid content, increased lipid peroxidation and decreased cholesterol content. It was also noted that these changes may have altered the signal transduction processes, ion permeability and many other primary functions of cell membranes could be altered. Keywords: Macrophage, CpG ODN, A151 ODN, FTIR spectroscopy | |||