| Tez Künye | Durumu | ||
| In vitro skeletal muscle model development through co-culture of cells / İn vitro iskelet kas modelinin ortak-kültür aracılığıyla geliştirilmesi Yazar:AYŞE BURCU ERTAN Danışman: DOÇ. DR. FATMA NEŞE KÖK ; PROF. DR. GAMZE KÖSE Yer Bilgisi: İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology Dizin: | Onaylandı Doktora İngilizce 2017 106 s. | ||
| İskelet kası kusurları çeşitli sebeplerden oluşabilir ve iskelet kas doku mühendisliği bu kaybın yeniden inşasını amaçlayan umut verici bir disiplinler arası yaklaşımdır. Kas dokusunun pedikül halinde yandaki ya da serbest halde uzaktaki kas dokusuna aktarılması, kas kusurlarının ve kayıplarının tedavisinde sıklıkla uygulanan bir yöntemdir, ancak, donör dokunun temin edilmesinin zor olması nedeniyle otolog greftleme için sınırlamalar vardır. İskelet kas dokusu mühendisliği, otolog öncü hücrelerden (kök hücreler) yeni kas dokusu üretimi sağlayarak bu sorunu çözmeye çalışır. İskelet kası dokusu mühendisliği uygulamaları için en çok tercih edilen hücre kaynakları, miyoblast hücre hattı ya da kas biyopsileri ile kolayca elde edilebilen ve in vitro kültürlenmiş uydu (satellit) hücreleridir. Nakledilen uydu hücreleri kas rejenerasyonuna katılabilir ve konakçı hayvanlarda uydu hücre popülasyonuna katkıda bulunurlar. Bu, uydu hücrelerini, kas dejenerasyonunda hücre bazlı transplantasyon tedavisi için mükemmel bir aday haline getirir. Kendi kendini yenilemenin yetersizliği, nakilden sonra donör hücrelerin kusurlu göçü, konakçının immün savunması ve hayatta kalma olasılığının azlığı, uydu hücrelerinin kliniklerdeki terapötik kullanımını etkileyen faktörlerdir. Uydu hücreleri, öncül hücre ve kök hücrelerden oluşan heterojen bir popülasyon olarak karakterize edilmiştir. Uydu hücresi hiyerarşisi hakkında tek hücre seviyesinde yapılacak daha kapsamlı bir araştırma gereklidir ve bunların performansı zamanla takip edilmelidir. In vivo işlevsellik içeren iskelet kası, vasküler, sinir, kas ve bağ dokuları gibi ana doku türlerinin indüksiyonunu gerektirir. Bundan böyle çeşitli kas dokuları; kas lifleri ve kasın tamamını kaplarken, iskelet kası kılcal damarlarla sarılır ve sinir dallarına bağlanır. Damarlanma, iskelet kası gibi yüksek oksijen ihtiyacı olan geniş dokularda önemli bir sorundur. Kas, oldukça metabolik bir organ olduğu için glikoz ve yağın depolanması ve parçalanmasından sorumludur. Ayrıca iskelet kası, egzersiz ve hiperinsülinemi sırasında artmış glukoz metabolizmasının sorumlu olduğu birincil dokudur. Bu kompleks sistemi in vitro koşullarda taklit etmek bir zorlu görevdir. Miyofiber, gelişme süresince birçok hücrenin birleşmesi ile oluşan geniş tek bir hücredir. Bu kas liflerinin bir araya toplanması kas oluşumuna neden olur. İskelet kası hücreleri motor nöronlar tarafından innerve edilir. Her nöron, az sayıda miyofiberi kontrol edebilir ve kasılmasına yardımcı olur. Miyogenez sırasında nöronal stimülasyona ihtiyaç vardır. Doku mühendisliği prensipleri yardımıyla, farklı kaynaklardan çok sayıda kök veya öncü hücreler kullanılarak farklılaştırılmış iskelet kası dokusu restore edilebilir. Vaskülarize edilmiş ve çok çekirdekli olgun kas liflerinin kendiliğinden rejenerasyonu, özelleşmenin sonlanması nedeniyle mümkün değildir. Uydu hücreleri veya miyoblastlar, yaralı kas dokusunun rejeneratif potansiyelini koruyabilir. Diğer dokularda da olduğu gibi, iskelet kasındaki damar ağı, giderek artan daha küçülerek dallanır. İskelet kasında, özelleşmiş arteriyol kas liflerine paralel çalışan kılcal damarlar oluşumlarına neden olur ve her kas lifi, bağımsız özelleşmiş arteriyollerin oluşturduğu kılcal gruplar tarafından beslenebilir. Kas dokusunun diğer paha biçilemez bileşeni olarak, motor nöronlar tarafından in vitro innervasyonun kurulması doğal dokuyu taklit ederek nöromüsküler kavşakları hedef alan ilaçların etkisini test etme fırsatı sağlar. Hem innerve hem de vaskülarize olan insan kas dokusu vücutta fonksiyonel dokuların oluşturulması için bize zaman kazandırırken, ilaç keşfi ve toksikoloji çalışmalarında kullanıldığında hayvan temelli sistemler arasındaki değişkenleri de ortadan kaldırır. Bu çalışma, iskelet kası kökenli kök hücreler ve insan umbilikal damar endotel hücreleri (HUVEC) kullanılarak yeni bir insan kas dokusu modeli oluşturulması üzerine bir araştırma sunmaktadır. Bu çalışmada, İskelet kası kök hücrelerinin izolasyonu pre-plate yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Hücreler, astrosit belirteci glial fibriler asidik protein (GFAP) için negatif ve nöronal beta-tubulin III ve nestin için pozitif nöron-benzeri hücrelere farklılaştırılmıştır. Kılcal ağ ve çok çekirdekli miyotüp oluşumu, optimize konsantrasyonda fetal sığır serumu kullanımı ve uygun ortam koşulları altında iskelet kası kök hücrelerinin HUVEC’lerle birlikte ortak-kültürlenmesi ile sağlanmıştır. In vitro koşullarda uydu hücreleri, miyoblastlara olgunlaştırılmış ve birleşmeleri sağlanarak miyotüpler oluşturulmuştur. Kılcal ağ ve çok çekirdekli miyotüp oluşumu, fetal sığır serumu ve ideal ortam koşulları altında iskelet kası kök hücrelerinin HUVEC’lerle birlikte kültürlenmesiyle sağlanmıştır. Hücreler, miyojenik belirteç desmin ve endoteliyel belirteç CD31 için immünolojik olarak boyanmıştır. HUVEC’lerin,% 5,% 10 ve% 20 FBS ile takviye edilmiş bir DMEM / F12 ortamında hayatta kalmadığı gözlenmiştir. Bununla birlikte, EGM-2 ortamı DMEM / F12 ile karıştırıldığında, HUVEC’ler hayatta kalmış ve çoğalmışlardır. Hem miyotüplerin hem de kılcal damar ağlarının oluşturulması için en iyi ortam kombinasyonu, DMEM / F12 (% 10 FBS): EGM-2 (% 2 FBS) (1: 1) karışımı olarak bulunmuştur. İnsan iskelet kası kök hücrelerinden üretilen nöron benzeri hücrelerin vaskülarize miyotüpler üzerine ekilmesi ile nöromüsküler kavşaklar oluşturulmuştur. Nöron benzeri hücrelerin, ortak- kültürden 24 saat sonra miyotüplerle temas ettiği bulunmuştur. İnsan iskelet kası kaynaklı kök hücrelerin (hSkMSC) sinirsel farklılaşmasını ve ortak-kültür koşullarında hücrelerin davranışını araştırmak için, hızlandırılmış zaman görüntüleme tekniği ile gerçek zamanlı gözlem yapılmıştır. Son olarak elektrofizyolojik çalışma ile çok çekirdekli hücrelerin kasılması faz kontrast mikroskopu altında gözlenmiştir. Bu çalışma, miyotüplerin ve nöronların etkileşimiyle geliştirilmiş kılcal ağlarla yeni bir in vitro insan iskelet kası modeli sunmaktadır. Bu model, ilaçların in vitro testinde ve ayrıca hücresel terapi yoluyla iskelet kaslarının yenilenmesi çalışmasında ya da hücre içeren doku mühendisliği biyomalzemeleri kullanılarak oluşturulacak kas yapılarının elde edilmesinde kullanılabilecektir. | |||
| Skeletal muscle defects occur because of several reasons and as a promising interdisciplinary approach, skeletal muscle tissue engineering aims the reconstruction of this loss. Transfer of an adjacent muscle tissue in a pediculated form or a distant one as a free flap is a method often applied in treatment of muscular defects and losses but there are limitations for autologous grafting because of the difficulty in procuring donor tissue. Generating new muscle tissue from autologous precursor cells (stem cells) attempts to address this problem via skeletal muscle tissue engineering. The most preferred source of cells for skeletal muscle tissue engineering applications is either a myoblast cell line or the primary satellite cells that can easily be obtained by muscle biopsies and cultured in vitro. Transplanted satellite cells can take part in muscle regeneration and contribute to the satellite cell population in host animals. This makes satellite cells perfect candidates for cell based transplantation therapy for muscle degeneration. Incapability of self-renewal, defective migration of donor cells after transplantation, host immune defense and poor survival are the factors that have affected therapeutic use of satellite cells in clinics. Satellite cells are characterized as a heterogeneous population of progenitors and stem cells. More comprehensive understanding on satellite cell hierarchy is needed at single cell level and their performance should be followed over time. Skeletal muscle that contains in vivo functionality requires the induction of main types of tissues such as vascular, nervous, muscle and connective tissues. Henceforth, numerous connective tissues cover the different muscle bundle, the muscle fibers and the whole muscle, while a skeletal muscle is instilled by capillaries and joined to the nerve branches. Vascularization is an important concern in capacious tissues having high oxygen demand such as the skeletal muscle. It is responsible for the storage and breakdown of glucose and fat since it is a highly metabolic organ. On top of that, skeletal muscle is the primary tissue accountable for the augmented glucose metabolism during exercise and hyperinsulinemia. It is a challange to mimic this complex system in vitro conditions. Myofiber is large single cell which is formed by fusion of many cells during development. Bundling of these muscle fibers leads to muscle formation. Skeletal muscle cells are innervated by motor neurons. Each neuron can control a small number of myofibers and fires a contraction. There is a need for neuronal stimulation during myogenesis. With the help of tissue engineering principles, differentiated skeletal muscle tissue can be restored by utilizing multiple stem or progenitor cells from different sources. Self regeneration of mature muscle fibers that are vascularized and multinucleated is not possible because of terminal differentiation. Satellite cells or myoblasts are capable of maintaining the regenerative potential of injured muscle tissue. As it is common in other tissues, the vascular network in skeletal muscle contains arteries splitting into increasingly smaller vessels. In skeletal muscle, a terminal arteriole gives rise to collections of capillaries that run parallel to muscle fibers, and each muscle fiber can be supplied by numerous unalike groups of capillaries from independent terminal arterioles. As the other invaluable component of the muscle tissue, in vitro establishment of innervation by the motor neurons would better mimic the native tissue and provide an opportunity to test the effect of drugs targeting the neuromuscular junctions. Both innervated and vascularized human muscle tissue construct is expected to have a reduced time for functional integration in the body and eliminate the species-related variability associated with animal-based systems when used in drug discovery and toxicology studies. This study presents a report on the generation of a novel human muscle tissue model using skeletal muscle derived stem cells and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). In this study, isolation of skeletal muscle stem cells was carried out by pre-plate method. They were differentiated into neuron-like cells that were negative for the astrocyte marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and positive for neuronal beta-tubulin III and nestin. Satellite cells matured in vitro into myoblasts and fused with each other and create the myotubes. Capillary network and multinucleated myotube formation were provided by the co-culture of skeletal muscle stem cells with the HUVECs under optimized fetal bovine serum and media conditions. Cells were immunostained for the myogenic marker desmin and the endothelial marker CD31. It was observed that HUVECs did not survive in a DMEM/F12 medium, supplemented with 5%, 10% and 20% FBS. When EGM-2 medium was mixed with DMEM/F12, however, the HUVECs survived and proliferated The best media combination for the formation of both myotubes and capillary networks was found as DMEM/F12 (10% FBS):EGM-2 (2% FBS) (1:1) mixture. The seeding of the neuron-like cells derived from the human skeletal muscle stem cells was performed on the vascularized myotubes to form neuromuscular junctions. It was found that the neuron-like cells were in contact with the myotubes after 24 hours of co-culture. Real time observation with time lapse imaging used in order to investigate neural differentiation of human skeletal muscle derived stem cells (hSkMSCs) and the behavior of cells in co-culture conditions. Finaly, electrophysiological study was carried out and contraction of the multinucleated cells was observed under the phase contrast microscope. This study presents a novel in vitro human skeletal muscle model with advanced capillary networks with an interaction of myotubes and neurons, and it can be utilized in the in vitro testing of drugs and also used for the regeneration of skeletal muscles by means of cellular therapy or cell-laden tissue engineered muscle constructs. | |||