| Tez Künye | Durumu | ||
| Construction and characterization of Arg16phe and Asp19leu mutations on bile salt hydrolase enzyme isolated from Lactobacillus plantarum in e.Coli / E.Coli de Lactobacillus plantarum dan izole edilen safra tuzu hidrolaz enziminde Arg16phe and Asp19leu mutasyonlarının oluşturulması ve karakterizasyonu Yazar:KÜBRA HACIBEYOĞLU Danışman: DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK Yer Bilgisi: Abant İzzet Baysal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2016 99 s. | ||
| Kardiyovasküler hastalıkların temel sebebi olarak gösterilen yüksek kolesterol seviyesinin düşürülmesinde probiyotiklerin önemli role sahip oldukları düşünülmektedir. Tedavi için kullanılan ilaçların pahalı ve çok fazla yan etkilerinin olması probiyotiklerin önemini artırmaktadır. Probiyotiklerin özellikle bağırsak bakterilerindeki Lactobacillus ve Bifidobacterium’un Safra Tuzu Hidrolaz (STH) enzimi ile kolesterol miktarını düşürdüğünü gösteren birçok çalışma bulunmaktadır ancak STH enzimi hakkında yeterince bilgimiz yoktur. STH enzimini karakterize etmek için kullanılan metotlardan biri yönlendirilmiş mutagenez yöntemi, diğeri de kristalografidir. Bununla birlikte, literatürde Cys2 aminoasiti dışında STH enzimi ile ilgili mutagenez çalışması bulunmamaktadır. Bu çalışmada, Lactobacillus plantarum türündeki tamamen korunmuş olan Arg-16 ve Asp-19 aminoasitleri uygun primerler kullanılarak pCON1 konstraktı içinde sırasıyla fenilalanin ve lösin aminoasitlerine dönüştürülmüştür. Daha sonra da mutant bsh genleri, pET22b ekspresyon vektörüne aktarılmıştır. Rekombinant mutant proteinler Ni2+ temelli kolon kullanılarak saflaştırılmış ve sonra da aktiteleri ve yapısı sırasıyla direk besi yeri ve ninhidrin testleri ile ve poliakrilamid jel elektroforezi ile analiz edilmiştir. Direk besiyeri ve Ninhidrin test sonuçları, tüm mutasyonların enzim inaktivasyonu ile sonuçlandığını gösterirken, poliakrilamid jel elektroforez sonuçları, Arg-16 mutant BSH proteinin katlandığını, ancak Asp-19 mutant proteinin katlanmadığını göstermiştir. Elde edilen sonuçlar; Arg-16 aminoasidinin BSH enziminin katalitik aktivitesinden sorumlu olduğunu, ortaya koyarken, Asp-19 aminoasitinin ise BSH enziminin katlanması ve stabilitesi için gerekli olduğunu göstermektedir. Bu çalışma; BSH enziminin, özellikle katalitik aktiviteden ve safra tuzlarına olan özgüllüğünden sorumlu olduğu varsayılan aminoasitler üzerinde daha fazla yönlendirilmiş mutagenez çalışmalarının gerekli olduğunu ortaya koymaktadır. | |||
| Probiotics are thought to have an important role in the lowering of the high cholesterol level that is shown as the main reason for cardiovascular diseases. Drugs used for treatment are expensive and have a lot of side effects so promoting the importance of the probiotics. There are a lot of studies proving that probiotics especially, intestinal bacteria such as Lactobacillus and Bifidobacterium, are lowering the amount of cholesterol with their Bile salt hydrolase (BSH) enzymes, but we do not know much about this enzyme. To characterize BSH enzyme one of the methods is; site direct mutagenesis and the other method is crystallography. However, no mutagenesis study on BSH enzyme was found in literature except Cys2 amino acid. In this study, fully conserved amino acids, Arg-16 and Asp-19 of L. plantarum species, were substituted for phenylalanine and leucine amino acids respectively in pCON1 construct using appropriate primers. Afterwards, mutant bsh genes were transferred to pET22b expression vector. The recombinant mutant proteins were purified using a Ni2+ chelated column and then were analyzed in respect to their activity and stability by direct plate assay, ninhidrin assay and polyacrylamide gel electrophoresis, respectively.While Direct plate assay and Ninhidrin assay results indicated that all of the mutations resulted in inactive BSH enzymes, polyacrylamide gel electrophorese results showed that Arg-16 mutant BSH protein was folded, but Asp-19 mutant protein was not. Our results revealed that while Arg-16 amino acid is responsible for the catalytic activity of BSH enzyme, Asp-19 amino acid is required for the folding of the BSH enzyme and its stability. Therefore, this work emphasized that further site directed mutagenesis studies, especially on the amino acids supposed to be responsible for catalytic activity and bile salt substrate specificity of the BSH enzyme, are required. | |||