| Tez Künye | Durumu | ||
| Effect of signal sequences and promoters in recombinant extracellular protein production by Pichia pastoris / Sinyal dizinlerin ve promotorların Pichia pastoris ile hücre-dışı rekombinant protein üretimine etkisi Yazar:ASLAN MASSAHI Danışman: PROF. DR. PINAR ÇALIK ; DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ D. SON Yer Bilgisi: Orta Doğu Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kimya Mühendisliği = Chemical Engineering Dizin: | Onaylandı Doktora İngilizce 2017 630 s. | ||
| Bu doktora tezinin amacı, hücre-dışı rekombinant protein üretim potansiyeli yüksek rekombinant Pichia pastoris (r-P. pastoris) suşu geliştirmektir. Bu kapsamda, rekombinant insan büyüme hormonu (rhGH) model protein olarak seçilmiştir. Birinci araştırma programında endojen sinyal peptidler (SP) kullanarak rhGH’nin hücre-dışına aktarımı incelenmiş, ikinci araştırma programında oksijen-kısıtlamalı koşullarda aktif promotorları içeren suşlar geliştirilmiştir. Bu çerçevede önce, pGAPZαA ve pPICZαA::hGH kullanılarak baz plazmid pGAPZαA::hGH geliştirilmiştir. rhGH’nin N-terminal ucuna 6 histidine ve faktör Xa proteaz tanıma bölgesi entegre edilmiştir. P. pastoris ile gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz promotoru (PGAP) altında üretilen rhGH’nin hücre-dışına aktarımı Saccharomyces cerevisiae α-çiftleşme faktörü prepro öncü sekansı (α-MF) ile gerçekleştirilmiştir. İlk araştırma programında, endojen sinyal peptid kodonları baz plazmiddeki α-MF kodonları yerine klonlanmıştır. Potansiyel yüksek SP’lerin belirlenmesi için, P. pastoris sekretom verileri ve in-silico analiz SignalP, Phobius, WolfPsort, ve ProP programları kullanılmıştır. SignalP sonuçları temelinde, α-MF’den yüksek D-puanına, sekansın sinyal peptidi olabilme özelliğini gösteren puana sahip SP’ler belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre seçilen endojen SP’ler: SP23 (MKILSALLLLFTLAFA), SP24 (MKVSTTKFLAVFLLVRLVCA), SP26 (MWSLFISGLLIFYPLVLG), ve SP34 (MRPVLSLLLLLASSVLA); ek olarak SP13 (MLSTILNIFILLLFIQASLQ) de, sonuçları literatürdeki çalışmalarla kıyaslamak için araştırılmıştır. İkinci araştırma programında, farklı oksijen aktarım koşullarında elde edilen proteom/transkriptom verileri incelenerek oksijen-kısıtlamalı koşullarında indüklenen promotorlar seçilmiştir. Seçilen üç promotor i) pirüvat kinaz geni promotoru (PPYRK), ii) pirüvat dekarboksilaz geni promotoru (PPDC), ve iii) primidin öncüsü biyosentez enzim thi3 geni promotoru (PTHI3), rhGH üretimi için baz plazmidde bulunan PGAP’in yerine klonlanması ve oksijen-kısıtlamalı koşulda rhGH üretimdeki artışın PGAP altında üretilen rhGH ile kıyaslanması planlanmıştır. α-MF’ün yerine, bulunan beş adet endojen SP, PGAP’in yerine de seçilen üç adet oksijen-kısıtlamalı koşulda indüklenen promotor ayrı-ayrı klonlanmıştır. Hazırlanan sekiz yeni plazmid, baz plazmid pGAPZαA::hGH ile birlikte E. coli’ye klonlanmış ve sonrasında P. pastoris transfekte edilmiştir. Tek-kopya gen içeren r-P. pastoris suşları gerçek-zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile seçilmişlerdir. Çalkalamalı- biyoreaktör deneyleri ile beş farklı SP içeren r-P. pastoris suşları ve baz plazmidi içeren r-P. pastoris suşu ile rhGH üretim deneyleri yapılmıştır. SP’lerin etkinliği, hücre-dışı r-protein üretiminde yaygın kullanılan α-MF (D-puanı=0.885) ile kıyaslanmış ve SP23 (D-puanı=0.883) en yüksek değere sahip olduğu için laboratuvar-ölçekli biyoreaktör deneyleri SP23 ve α-MF suşları ile gerçekleştirilmiştir. Maksimum hücre derişimi t = 15 st’ta α-MF ve SP23 suşları için, sırasıyla, 82 g/L ve 75 g/L olarak bulunmuştur. Ayrıca, en yüksek hücre-dışı rhGH derişimi α-MF ve SP23 suşlarıyla, sırasıyla, 70 mg/L ve 56 mg/L olarak t = 12 st’ta ulaşılmıştır. Hücreiçi rhGH derişimleri de α-MF öncü-sekansı ile rhGH’nin daha iyi salgılandığını doğrulamıştır. Sonuçta, SP23’ün etkinliğinin α-MF’nin %70-80’i kadar olduğu bulunmuştur. Her ne kadar α-MF’nin ayrıcalıklı durumu izoelektrik nokta (pI), hidrofobiklik ve alifatik indeks gibi temel fizikokimyasal özelliklere kısmen bağlı olsa da, endojen SP’lerin etkinliği ve fizikokimyasal özellikleri arasında net bir ilişki bulunamamıştır. Üç promotor geni içeren r-P. pastoris suşları ile birlikte baz plazmidi içeren r-P. pastoris suşu ile gerçekleştirilen çalkalamalı-biyoreaktör üretim deneylerinde PTHI3’ün rhGH ekspresyonunu gerçekleştiremediği görülmüş ve suş elenmiştir. Laboratuvar-ölçekli biyoreaktör deneyleri, üç oksijen-kısıtlamalı koşullarda indüklenen promotorlar ile gerçekleştirilmiş ve rhGH ekspresyon seviyeleri PGAP ile kıyaslanmaştır. En yüksek hücre derişimi t = 15 st’ta 80 g/L, 82 g/L ve 90 g/L olarak, sırasıyla, PPYRK, PPDC, ve PGAP içeren suşlar ile elde edilmiştir. Bunun yanında, en yüksek hücre-dışı rhGH derişimi 101 mg/L, 122 mg/L ve 58 mg/L olarak, sırasıyla, PPYRK, PPDC, ve PGAP ile elde edilmiştir. Metabolik akı analizleri 102 metabolit ve 146 tepkimeden oluşan stokiyometrik kütle-korunum temelli P. pastoris matematik modeli ile yapılmıştır. Hesaplanan tepkime akıları, oksijen-kısıtlamalı koşulda üretilen etanol ve, pirüvik, asetik ve laktik asit gibi, organik asitlerin yolizi akılarını doğrulamış; prosesin oksijen-kısıtlamalı fermentatif metabolizmaya kaydığını göstermiştir. Üç promotor altında mRNA düzeyleri, t = 9 st’ta kadar hücre-dışı rhGH üretimi ile paralel sonuç vermiştir. Sonuç olarak, deney sonuçlarına ve rhGH derişimleri temelinde, uygulanan strateji ve koşullar altında PPDC oksijen-kısıtlamalı koşullarda en etkili indüklenen promotor olarak seçilmiştir. | |||
| The objective of the current research was to develop a recombinant Pichia pastoris (r-P. pastoris) strain having high-performance extracellular recombinant protein production potential. In this context, human growth hormone (rhGH) was considered as model protein, and in the first research programme endogenous secretion signal peptides (SP) for the secretion of rhGH were examined; thereafter, strains having promoters that work under oxygen limitation conditions were developed. At first step, the base plasmid, pGAPZαA::hGH, was developed by two parent plasmids, pGAPZαA and pPICZαA::hGH, in which the rhGH gene was fused to a fusion partner including 6His-tag and factor Xa protease cleavage site at N-terminus. In base plasmid, the expression of rhGH was driven by glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene promoter (PGAP) and its subsequent secretion to the extracellular medium was achieved by Saccharomyces cerevisiae α-mating factor prepro leader sequence (α-MF). In the first research programme the endogenous SPs were selected in order to replace the original α-MF in base plasmid. For this purpose, at first step, in-silico analyses were conducted by recruitment of softwares including: SignalP, Phobius, WolfPsort, and ProP by using a secretome dataset of P. pastoris as inputs of the analyses in order to predict potential efficient SPs. The SPs with higher D-score, the score quantifying the signal peptide-ness of a given sequence, which is the output of the SignalP were selected in comparison with widely-used α-MF. Based on the obtained results the selected endogenous SPs were SP23 (MKILSALLLLFTLAFA), SP24 (MKVSTTKFLAVFLLVRLVCA), SP26 (MWSLFISGLLIFYPLVLG), and SP34 (MRPVLSLLLLLASSVLA); in addition, SP13 (MLSTILNIFILLLFIQASLQ) was included in the candidates in order to compare the secretion results with previous studies. In the second research programme, the potentially-efficient oxygen limitation-induced promoters were selected by analysing a proteome/transcriptome dataset obtained in different oxygenation levels; subsequent comparison of the fold of increase in protein level in oxygen-limitation condition with GAP enzyme lead to the selection of the three promoters including: pyruvate kinase gene promoter (PPYRK), pyruvate decarboxylase gene promoter (PPDC), and pyrimidine precursor biosynthesis enzyme thi3 gene promoter (PTHI3). These promoters were intended to replace the original PGAP in base plasmid. In the subsequent step replacement of the α-MF with five selected endogenous SPs and replacement of the PGAP with selected three oxygen limitation-induced promoters was conducted. The prepared eight new plasmids along with base plasmid were cloned in E. coli and were, subsequently, used for transfection of P. pastoris. The confirmed transfectants were passed through copy number determination experiments and single-copy r-P. pastoris strains were selected using real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Shake-bioreactor experiments were performed using five r-P. pastoris strains of SPs along with r-P. pastoris strain of base plasmid to assess the efficiency of SPs in secretion of rhGH compared to α-MF. The results revealed that the highest secretion efficiency of the endogenous SPs belonged to SP23 (D-score=0.883) which was comparable to α-MF (D-score=0.885). For further confirmation, laboratory-scale bioreactor experiments were conducted with two strains of SP23 and α-MF. The cell concentration reached to the maximum amount of 82 g/L and 75 g/L for α-MF and SP23 strains, respectively, at t=15 h. In addition, the secreted rhGH reached to maximum concentration of 70 mg/L and 56 mg/L for α-MF and SP23 strains, respectively, at t=12 h. Intracellular rhGH concentration also approved the better secretion of rhGH under leadership of α-MF. Overall, the efficiency of SP23 was obtained to be about 70-80% of the α-MF. Although the privilege of α-MF could be ascribed partially to major physicochemical properties like isoelectric point (pI), hydrophobicity, and aliphatic index, no clear relationship between the efficiency of the endogenous SPs and their corresponding physicochemical properties was found. Second-group shake-bioreactor experiments conducted with three r-P. pastoris strains of selected promoters along with r-P. pastoris strain of base plasmid revealed inability of the PTHI3 in expression of rhGH; thus, it was discarded. Then, laboratory-scale bioreactor experiments were conducted with the remaining three r-P. pastoris strains to investigate the efficiency of selected oxygen limitation-induced promoters in expression of rhGH compared to PGAP. The maximum cell concentration was obtained at t=15 h as 80 g/L, 82 g/L, and 90 g/L for recombinant strains related to PPYRK, PPDC, and PGAP, respectively. In addition, the maximum secreted rhGH was obtained as 101 mg/L, 122 mg/L, and 58 mg/L for PPYRK, PPDC, and PGAP, respectively. Metabolic flux analysis performed by using a mass-balance based stoichiometric model with 102 metabolites and 146 reactions. Using the elaborate fermentation data the intracellular P. pastoris fluxes were calculated which disclosed the relationship between the oxygen limitation and the fluxes through the branched pathways from pyruvate node, the energy content of the cell in the form of ATP, together with the cell synthesis flux. The excreted ethanol during oxygen limitation and the excreted organic acids like pyruvic acid, acetic acid, and lactic acid, all confirmed the fluxes through the branched pathways and revealed the shift towards the fermentative metabolism under oxygen limitation. Moreover, the mRNA level of the rhGH transcribed under three different promoters was in agreement with the extracellular rhGH level until t=9 h. Overall, based on the conducted experiments and measured final rhGH titer, PPDC was selected as the most efficient oxygen limitation-induced promoter regarding the adopted strategy and conditions. | |||