| Tez Künye | Durumu | ||
| Genome editing of the IL-7 receptor gene locus using talens / Il-7 almaç geni̇nde talen protei̇nleri̇ i̇le genom mühendi̇sli̇ği̇ Yazar:GÜLPERİ YALÇIN Danışman: DOÇ. DR. MEHMET BATU ERMAN Yer Bilgisi: Sabancı Üniversitesi / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı Konu:Biyokimya = Biochemistry ; Biyoloji = Biology ; Biyomühendislik = Bioengineering Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2014 127 s. | ||
| IL-7 sinyallemesi memeli bağışıklık sisteminde lenfosit gelişimi ve fonksiyonu için anahtar konumundadır. Bu çalışmanın ilk bölümünde IL-7R alfa gen bölgesini hedefleyip gen ifadesini kontrol eden faktörleri tespit etmeyi amaçladık. Transcription activator-like effector nükleaz (TALEN) proteinleri ile enhancer bölgesindeki iki transkripsiyon faktör bağlanma bölgesinde mütasyonlar oluşturduk. Glukokortikoid almacı (GR) ve Notch bağlanma bölgelerini hedefleyen iki çift TALEN ile birlikte 2. ve 3. ekzon bölgelerini hedefleyen TALEN’ler oluşturup aralarındaki intron bölgesindeki transkripsiyon kontrol elementlerini genomdan silmeyi planladık. Bu TALEN’leri fare RLM11 (IL-7R+) hücre hattında ifade edip RFLP yöntemi ve DNA sekanslaması ile oluşturduğumuz mütasyonları tespit ettik. Mutant hücre hatlarının IL-7R ifadelerini analiz ederek Notch bağlanma bölgesindeki mütasyonların gen ifadesinde azalmaya yol açtığını, fakat GR bağlanma bölgesindeki mütasyonların bu ifade seviyesini düşüremediğini gözlemledik. Çalışmanın ikinci bölümünde doğrudan GR transkripsiyon faktörünün gen bölgesini hedefledik. Translasyon başlangıç bölgesinde çift sarmallı kesik oluşturacak bir TALEN çifti tasarlayıp gen “knockout” yapmayı amaçladık. Bu TALEN’leri insan HCT116 hücre hattında ifade edip RFLP ile mütasyonları tespit ettik. Deneylerimiz TALEN teknolojisi ile genomun modifiye edilip gen ifadesini kontrol eden faktörlerin çalışılabileceğini göstermektedir. | |||
| IL-7 signaling is key to lymphocyte development and function in the mammalian immune system. In the first part of this study, we targeted the IL-7R alpha gene locus, encoding the IL-7 receptor protein, to identify its transcriptional control elements. We mutated two transcription factor binding sites in an evolutionarily conserved region containing a putative transcriptional enhancer by generating transcription activator like effector nucleases (TALENs) targeting these sites. We designed and constructed two pairs of TALENs targeting the glucocorticoid receptor (GR) and Notch binding sites in this region. We also targeted the exon 2 and exon 3 of IL-7R to delete a transcriptional control element in intron 2. We expressed these TALENs in the murine RLM11 (IL-7R positive) cell line and generated insertion and deletion mutations in the targeted sites. We used restriction fragment length polymorphism (RFLP) assays and DNA sequencing to detect the induced mutations and assessed their effects on IL-7R gene expression. We demonstrate that mutations induced in the GR transcription factor binding site do not reduce IL-7R gene expression, while mutations in the Notch binding site lower expression. In the second part of the study we directly targeted the gene encoding the GR transcription factor. We designed a TALEN pair targeting the translation start site to knockout gene expression. We introduced these TALENs into the human HCT116 cell line and performed RFLP assays to detect mutations. Our experiments demonstrate that TALENs can be used for genome editing to study gene transcription regulatory regions. | |||