| Tez Künye | Durumu | ||
| Investigation of the effect of KX2-361 molecule on post-intoxication of Botulinum Neurotoxin Serotype A, using motor neurons differentiated from mouse embryonic stem cell line HBG3 / KX2-361 molekülünün Botulinum Nörotoksini Serotip A ile zehirlenme sonrası koşullara etkisinin HBG3 fare kök hücrelerinden farklılaştırılmış motor nöronlarda incelenmesi Yazar:DİLARA KOÇ Danışman: DOÇ. DR. ERKAN KİRİŞ Yer Bilgisi: Orta Doğu Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2022 78 s. | ||
| Botulinum Nörotoksinleri (BoNTs) bilinen en zehirli bakteri toksini olup ölümle sonuçlanabilen botulizm hastalığına sebep olur. 7 BoNT serotipinden biri olan BoNT/A insan botulizmine sebep olan en yaygın serotiptir. BoNT/A, öncelikli olarak periferik kolinerjik nöronları, özellikle de motor nöronları hedef alır ve SNAP-25 proteinini keserek asetilkolin salınımını inhibe eder. BoNTlar motor nöronların içine nüfuz ettikten sonra toksini hücre içinde nötralize edebilecek bir tedavi bulunmamaktadır. Önceki çalışmalarımız, küçük molekül kütüphanelerini BoNT/A’ya karşı inhibe edici aktiviteleri açısından değerlendirmiştir. Bu çalışma, motor nöron deneylerinde, bir BoNT/A inhibitörü olarak bir Src inhibitörü olan KX2-391’in (Tirbanibulin) keşfedilmesine yol açmıştır. Bileşiğin umut verici özelliklerine rağmen, ne yazık ki, KX2-391 farelerde BoNT/A zehirlenmesine karşı önemli ölçüde koruma sağlayamamıştır. in vivo çalışmalardan elde edilen sonuçların olası bir nedeni, KX2-391’in Kan-Beyin Bariyerini (BBB) geçmek için yetersiz penetrasyon kapasitesi olabilir. Son zamanlarda, özellikle BBB’yi geçmek için tasarlanmış KX2-391’in yapısal bir analoğu olan KX2-361 geliştirildi ve yayınlandı. Bu nedenle, bu tez çalışmasında öncelikli amacımız KX2-361’in BoNT/A’ya karşı inhibe edici etkilerini değerlendirmekti. Bu amaç doğrultusunda, hem KX2-391 hem de KX2-361 moleküllerini, PC12 hücrelerinde hücre canlılığı üzerindeki potansiyel etkileri açısından MTT tahlili ile değerlendirdik ve bulgularımız özellikle düşük dozlarda hücre canlılığında önemli bir farklılık göstermedi. Daha sonra, HBG3 fare embriyonik kök hücrelerinden farklılaştırılmış motor nöronlar elde ettik ve KX2-361’in motor nöronlar üzerindeki olası toksik etkilerini görüntüleme tabanlı tahlillerle test ettik. Bunu takiben, mESC’den farklılaştırılan motor nöronlarda bileşiğin BoNT/A’ya karşı inhibe edici etkilerini zehirlenme öncesi koşullarda test ettik ve heyecan verici bir şekilde KX2-361’in, toksine karşı doza bağlı koruma sağladığı görüldü. Daha sonra bileşiği, zehirlenme sonrası koşullarda değerlendirdik ki bu koşullarda da bileşiğin toksine karşı aktivite sergilediği görüldü. Ayrıca, KX2-361, BoNT/A LC ile transfekte edilmiş PC12 hücrelerinde BoNT/A LC enzimatik bileşenlerini inhibe edebildi. Bu çalışmanın sonuçları, BoNT/A’ya karşı etkinliğini artırmak için KX2-361’in yapısal analoglarını geliştirmek için yeni yollar açabilir ki bu da BoNT zehirlenmesine karşı ilaç geliştirme çabaları için kritik bir öncü bileşik sağlayabilecektir. | |||
| Botulinum neurotoxins (BoNTs) are the most poisonous neurotoxins known, and intoxication by this toxin leads to botulism, a potentially lethal disease. BoNT/A, one of the 7 serotypes of BoNTs, is the most common serotype that causes human botulism. BoNT/A primarily targets the peripheral cholinergic nerves, especially motor neurons, and causes inhibition of acetylcholine release by cleaving SNAP-25 protein. Once BoNTs are internalized into motor neurons, there are no therapeutic options to neutralize them within the cytoplasm. Our previous studies evaluated libraries of small molecules for their inhibitory activities against BoNT/A. Such work led to the discovery of an Src inhibitor, KX2-391 (Tirbanibulin), as a BoNT/A inhibitor in motor neuron assays. Despite the promising features of the compound, unfortunately, KX2-391 failed to protect significantly against BoNT/A intoxication in mice. One possible reason for results obtained from in vivo studies may be the insufficient penetration capacity of KX2-391 to cross the Blood-Brain Barrier (BBB). Recently, a structural analog of KX2-391, KX2-361, specifically designed to cross BBB, has been developed and published. Therefore, in this thesis work, our primary goal was to evaluate the inhibitory effects of KX2-361 against BoNT/A. Towards this goal, we evaluated both KX2-391 and KX2-361 molecules for their potential effects on cell viability in PC12 cells via MTT assay, and our findings show no significant cell viability differences, especially with lower doses. We then generated motor neurons from HBG3 mouse embryonic stem cells and tested the possible effects on cell viability of KX2-361 on motor neurons with imaging-based assays. Following this, we tested the compound’s inhibitory effects against BoNT/A in mESC-derived motor neurons in pre-intoxication conditions, and excitingly, KX2-361 provided dose-dependent protection against the toxin. We then evaluated the compound in post-intoxication conditions, which exhibited activity against the toxin. Furthermore, KX2-361 inhibited BoNT/A LC enzymatic components in PC12 cells transfected with BoNT/A LC. The results of this work may open new avenues to develop structural analogs of KX2-361 to increase its efficacy against BoNT/A, which may provide a critical lead compound for drug development efforts against BoNT intoxication. | |||