| Tez Künye | Durumu | ||
| Investigation of the mitochondrial metabolism of Helicobacter-activated B cells / Helikobakter ile aktive edilmiş B hücrelerinin mitokondriyal metabolizmasının araştırılması Yazar:ZEYNEP NUR ŞENTÜRK Danışman: PROF. AYÇA SAYI YAZGAN Yer Bilgisi: İstanbul Teknik Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı / Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı Konu:Allerji ve İmmünoloji = Allergy and Immunology ; Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2022 84 s. | ||
| Helikobakter pilori (H.pilori) gram-negatif, mikroaerofilik ve spiral şekilli bir bakteri olup Helicobacteraceae ailesine aittir. H.pilori 1982 yılında Warren ve Marshall tarafından keşfedilmiştir. Helikobakter enfeksiyonu kronik gastrit, gastrik kanser, peptik ülser hastalığı ve mukoza ile ilişkili lenfoid doku lenfoması gibi birçok gastro patolojiye yol açabilir. Dünya nüfusunun %50’si H. pilori ile enfekte olup, H. pilori ile enfekte bireylerin %80’i asemptomaktir. H. pilori’ ye benzer şekilde , H.felis’de gram negatif, üreaz-pozitif, spiral şekilli ve mikroaerofilik bir bakteridir. Fare modellerinde yapılan çalışmalar, H.felis’in gastrik atrofi, metaplazi, displazi, kronik ve kalıcı inflamasyon ve gastrik kansere sebep olduğunu göstermiştir. H. pilori’nin farelerde etkili bir immün cevap oluşturma kapasitesi düşük olduğu için, bu patojenin çalışılabilmesi amacıyla fare modelleri geliştirilmesinde Helikobakter felis (H.felis) kullanılmaktadır. B hücreleri T hücrelerine antijen sunumu yaparak ve antikor üreterek adaptif immünitede önemli rol oynarlar. Son zamanlarda, anti inflamatuar ve immün sistemi baskılayıcı özellikleri olan yeni B hücre alt tipleri keşfedilmiştir. Bu B hücreleri Bhan ve çalışma arkadaşları tarafından regülatör B hücreler (Breg) olarak adlandırılmıştır. CD19+CD21hiCD23hiCD24hi translasyonel 2 marjinal zon hücreleri (T2-MZP), IL-10 üreten CD1dhiCD5+ B10 hücreleri, CD19+CD21hi CD23- marjinal zon (MZ) B hücreleri, Tim-1+ B hücreleri, CD19+CD5+ B1a hücreleri, CD9+ B hücreleri, CD138+ plazma B hücreleri ve CD138+CD44hi plazmablast Breg alt grupları farelerde tanımlanmış regülatör B hücreleridir. Regülatör B hücreler immün tolerans ve efektör immün hücre yanıtını dengelemek için IL-10, IL-35 ve TGF-ꞵ sitokinlerini salgılar. Bu sitokin moleküllerine ek olarak, Breg hücreleri immün sistemi baskılayıcı fonksiyonlarını gerçekleştirmek için CD39, CD73, programlanmış ölüm ligandı 1 (PD-L1) ve aril hidrokarbon reseptörleri gibi hücre zarına bağlı diğer molekülleri de kullanmaktadırlar. H. felis B hücrelerini TLR2 ve Myd88 sinyal yolağı aracılığı ile indükler ve bu indükleme IL-10 üreten B hücreleri ile sonuçlanır. Breg hücreleri Helikobakter ilişkili patolojileri baskılayabilmek için T hücreleri ile etkileşime girerek naif CD4+ T hücrelerinin IL-10 üreten regülatör T hücrelerine farklılaşmasını sağlar. Metabolizma, sırasıyla hücrede yer alan moleküllerin yapım ve yıkımlarını içeren anabolik ve katabolik reaksiyonlardan oluşmaktadır. Oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) hücre içinde gerçekleşen en önemli metabolik yolaklardan biridir. Oksidatif fosforilasyon mitokondride gerçekleşir ve enerji üretiminde görev alan trikarboksilik asit ve elektron transport zinciri reaksiyonlarını içermektedir. Oksidatif fosforilasyonda kısaca, trikarboksilik asit döngüsü sonucunda elektron transport zincirine aktarılan elektronlar, oksijen molekülü ile birleşir ve oksidasyon/redüksiyon reaksiyonları sonucunda ADP molekülünden ATP oluşumu ile hücrelerden enerji salınımı gerçekleşir. Mitokondri, ökaryotik hücrelerde bulunan ve hem dış hem de iç mitokondriyal membrana sahip çift membranlı bir organeldir. Membran transportları ve elektron transport zinciri mitokondriye ait iç mitokondriyal membranda (İMM) yer almaktadır. İMM içerisinde mitokondriyal matriks olarak adlandırılan viskoz bir yapı bulunmaktadır. Enzimler, mitokondriyal DNA (mtDNA), ribozomlar ve nükleotitler mitokondriyal matriks içinde yer almaktadır. Mitokondriyal DNA; 22 adet transfer RNA, 2 adet ribozomal RNA ve 13 adet oksidatif fosforilasyonda rol alan polipeptit (ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5, ND6 (Kompleks I’in yapısına katılırlar); Cytochrome b (Kompleks III’ün yapısına katılırlar), COI, COII, COIII (Komplex IV’ün yapısına katılırlar) ve ATP6, ATP8 (Komplex V’in yapısına katılırlar)) olmak üzere 37 adet mitokondiyal geni kodlamaktadır. Mitokondriyal bir genin ekspresyonunun gerçekleşebilmesi için mitokondriyal DNA’nın mitokondriyal transkripsiyon faktörü A (Tfam), mitokondriyal RNA polimeraz (POLRMT) ve mitokondriyal transkripsiyon faktörü B1 ve B2 (Tfb1m ve Tfb2m) tarafından transkribe edilmesi gerekir. Çok hücreli hayat için gerekli iki hücresel fonksiyon; sırasıyla besin maddelerinin hücre, doku ve organlar arasında dağıtılması ve organizmanın inflamasyondan korunması olarak tanımlanan metabolizma ve immünitedir. Son yıllarda çalışmalar; canlılık, aktivasyon, farklılaşma ve fonksiyonları kapsamında immün hücrelerin enerji metabolizmalarının aydınlatılmasına odaklanmıştır. İmmün hücrelerin aktivasyonunun sağlanabilmesi için gerekli sinyal yolakları; metabolik ara bileşenler ve ATP’ye ihtiyaç duyar. Bu yüzden enerji üretimini sağlayan mitokondriyal metabolizma; immün hücre aktivasyonu, farklılaşması ve fonksiyonunun uygun şekilde sürdürülmesinde kritik bir rol oynar. Çalışmalar B hücrelerinin, B hücre reseptörü (BCR) veya Toll-benzeri reseptörler (TLR) ile aktivasyonu sonucunda mitokondriyal dinamiklerini değiştirdiklerini göstermektedir. LPS ile uyarılan B hücreleri mitokondriyal kütlelerini artırırken, B hücre reseptör ligandı IgM ve TLR9 ligandı CpG ile eş zamanlı uyarılan B hücreleri ise mitokondriyal biogenezini artırmaktadır. Bunlara ek olarak, CD40 ve IL-4 ile stimule edilen B hücreleri oksidatif fosfororilasyon yapmaktadır. Ancak literatürde Helikobakter ile aktive edilen B hücrelerinin mitokondriyal metabolizmaları ile ilgili herhangi bir bilgi bulunmamaktadır. Bu çalışmanın asıl amacı, Helikobakter ile aktive edilen B hücrelerinin mitokondriyal metabolizmasını aydınlatmaktır. Bu amaçla, öncelikle B hücreleri C57BL6 farelerinin dalaklarından manyetik olarak izole edildi ve 6, 24 ve 48 saat boyunca H. felis antijeni, PAM3CSK4, ve LPS ile uyarıldı. Daha sonrasında, hücreler belirtilen saat aralıklarında toplanarak, hücrelerin mitokondriyal kütle ve membran potansiyelleri sırasıyla Mitoview Green ve Mitoview 633 ya da TMRE boyaları kullanılarak akan hücre ölçerde analiz edildi. Bu hücrelerin süpernatantları, IL-10 salınım miktarlarının tayin edilebilmesi için IL-10 ELIZA deneyleri sırasında kullanıldı. H. felis antijeni, PAM3CSK4, ve LPS ile stimüle edilen B hücreleri baskılayıcı kapasitelerinin göstergesi olarak IL-10 üretimlerini, 24 ve 48 saatte belirgin olarak artırmıştır. Ayrıca uyarılmamış kontrol grubuna kıyasla, uyarı alan tüm gruplar 24 ve 48 saatte hem mitokondriyal kütlelerini hem de mitokondriyal membran potansiyellerini artırmıştır. Çalışmamızın ikinci amacı, yüksek membran potansiyeline sahip B hücrelerinin IL-10 sitokinini üretip üretmediğini göstermekti. Bu yüzden, B hücreleri IL-10 GFP reporter (VertX IL10 egfp) farelerin dalaklarından izole edildikten sonra, 6, 24 ve 48 saat boyunca H. felis antijeni, PAM3CSK4, ve LPS ile stimüle edildi. Mitokondriyal membran potansiyeli ve Mitoview 633 pozitif B hücrelerinin IL-10 GFP sinyali akan hücre ölçer kullanılarak analiz edildi. Bu B hücreleri ayrıca Mitoview 633 ve IL-10 GFP sinyalleri bakımından “quadran” analizi ile değerlendirildi. Quadran analizi Mitoview 633- IL-10- (iki belirte. Içinde negative B hücre popülasyonu), Mitoview 633- IL-10+(sadece IL-10 pozitif B hücreleri), Mitoview 633+ IL-10- (sadece Mitoview 633 pozitif B hücreleri) ve Mitoview 633+ IL-10+ (iki belirteç içinde pozitif B hücre popülasyonu) olmak üzere 4 ayrı popülasyon göstermektedir. 6 saatte IL-10+ Mitoview 633+ B hücrele yüzdelerinde kontrol grubuna kıyasla herhangi bir değişiklik gözükmez iken; uyarı alan B hücreleri 24 ve 48 saatte IL-10+ Mitoview 633+ B hücre yüzdelerini kontrol grubuna göre anlamlı olarak artmıştır. Elde ettiğimiz veriler, H. felis antijeni, PAM3CSK4, ve LPS ile uyarılan Mitoview 633 pozitif B hücrelerinin uyarı almayan gruba kıyasla 24 ve 48 saatte IL-10 GFP sinyallerini artırdığını göstermektedir. Ayrıca; IL-10 üreten B hücrelerinin neredeyse tamamının aynı zamanda yüksek mitokondriyal potansiyele sahip olduğu gözlenmiştir. Çalışmamızın üçüncü amacı ise mitokondriyal biogenez belirteçlerini araştırmaktı: mtDNA:nDNA oranı ve mitokondriyal transkripsiyon faktör A (Tfam) geninin ifade seviyesi. Q-PZR deneylerini gerçekleştirmek adına izole edilen ve uyarılan B hücreleri 6, 24 ve 48 saat sonunda toplanarak hücre pelletlerinden DNA ve RNA izolasyonu yapıldı. mtDNA:nDNA oranını Q-PZR’da tayin edebilmek için sırasıyla sitokrom c oksidaz subunit 1 ve ribozomal protein 18S genleri gen spesifik primerler kullanılarak hedef alındı. H. felis antijeni, PAM3CSK4, ve LPS ile uyarılan B hücreleri uyarı almayan gruba kıyasla mtDNA:nDNA oranlarını azaltırken, Tfam ifade seviyelerini artırmıştır. Sonuç olarak bu çalışma; H.felis ile aktive edilen B hücrelerinin, aktif/fonksiyonel mitokondrilere sahip olduğunu, oksidatif fosforilasyonu artırdığını ve IL-10 üretimlerinin mitokondriyal metabolizmaları ile ilişkili olabileceğini göstermiştir. | |||
| Helicobacter pylori (H. pylori) is a gram-negative, microaerophilic, and spiral-shaped bacterium and a member of the Helicobacteraceae family. H. pylori was discovered in 1982 by Warren and Marshall. Helicobacter infection can lead to multiple gastro pathologies such as chronic gastritis, gastric cancer, peptic ulcer disease, and mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma. Whereas more than 50% of the world population has been infected with H. pylori, 80% of them are asymptomatic. Similar to H. pylori; H. felis is a gram-negative, urease-positive, spiral-shaped, and microaerophilic bacteria. Studies have shown that H. felis can induce gastric atrophy, metaplasia, dysplasia, chronic and persistent inflammatory response, and gastric cancer in mice models. Because H. pylori have less capacity to activate an efficient immune response in mice compared to Helicobacter felis (H. felis); H. felis is used to generate mice models for studying this pathogen. B cells play critical roles in adaptive immunity with antigen presentation to T cells and antibody production. Recently, new B cell subsets have been shown to exert anti-inflammatory and immune suppressive properties were discovered. These B cells are termed regulatory B cells (Bregs) by Bhan and colleagues. In mice; mainly CD19+CD21hiCD23hiCD24hi transitional 2 marginal-zone precursor cells (T2-MZP), IL-10 producing CD1dhiCD5+ B10 cells, CD19+CD21hi CD23- marginal-zone (MZ) B cells, Tim-1+ B cells, CD19+CD5+ B1a cells, CD9+ B cells, CD138+ plasma B cells, and CD138+CD44hi plasma blasts are identified as Breg subsets. For maintaining host immune tolerance and balance effector immune responses, these Breg cells secrete IL-10, IL-35, and TGF-ꞵ cytokines. In addition to cytokines, Breg cells also use cell membrane-bound molecules such as CD39, CD73, programmed death-ligand 1(PD-L1), or aryl hydrocarbon receptors for their functions. Stimulation of B cells with H. felis; signals via TLR2 and MyD88 and results with IL-10 producing Bregs. Bregs can induce differentiation of naive CD4+ T cells to IL-10-producing regulatory Tr1 cells by direct B and T cell interactions for suppressing Helicobacter-associated pathologies. Metabolism is the collection of all anabolic and catabolic reactions which are the generation and breakdown of cellular substances respectively. Oxidative phosphorylation (OXPHOS) is one of the major metabolic pathways inside the cell. It occurs in the mitochondria and consists of the tricarboxylic acid cycle (TCA) and electron transport chain reactions for generating ATP. Shortly, in OXPHOS electrons formed from the tricarboxylic acid cycle (TCA); are combined with molecular oxygen (final acceptor of electron transport chain) and this results in many oxidation/reduction reactions where energy is released for the production of ATP from ADP. Mitochondria are double membrane organelles that have both outer and inner mitochondrial membranes (OMM and IMM) and are found in eukaryotic cells. Membrane transporters and electron transport chain (ETC) complexes of mitochondria localize on the inner mitochondrial membrane. IMM encloses a viscous structure called a mitochondrial matrix. Enzymes, mitochondrial DNA (mtDNA), ribosomes, and nucleotides are placed in the mitochondrial matrix. Mitochondrial DNA encodes 37 mitochondrial genes including 22 transfer RNAs, 2 ribosomal RNAs, and 13 important oxidative phosphorylation polypeptides: ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5, ND6 (parts of Complex I); Cytochrome b (parts of Complex III), COI, COII, COIII (parts of Complex IV) and ATP6, ATP8 (parts of Complex V). To provide expression of a mitochondrial gene, mitochondrial DNA needs to be transcribed by mitochondrial transcription factor A (Tfam), mitochondrial RNA polymerase (POLRMT), and mitochondrial transcription factor B1 and B2 (Tfb1m and Tfb2m). Two of the most critical features of multicellular life are metabolism and immunity. These can be explained as the need to distribute nutrients across cells, tissues & organs and protect from injury and inflammation. In recent years, studies have focused on elucidating the metabolism of immune cells in the context of their survival, activation, differentiation, and functions. For the activation of immune cells, signals which are triggered by metabolic intermediates and ATP molecules are required. In order to maintain proper immune cell activation, differentiation, and function, mitochondrial metabolism which generates energy plays a critical role. Studies have demonstrated that B cell activation with B cell receptor (BCR) or different Toll-like receptor (TLR) ligands changes mitochondrial dynamics. LPS-stimulated B cells enhance mitochondrial mass, and co-stimulation of B cells with BCR ligand IgM and TLR9 ligand CpG increases mitochondrial biogenesis. In addition to that, anti-CD-40 and IL-4 stimulated B cells to undergo OXPHOS. However, there is no information in the literature about the mitochondrial metabolism of Helicobacter-activated B cells. The main aim of this study is to elucidate the mitochondrial metabolism of Helicobacter-infected B cells. For this purpose, B cells were magnetically isolated from spleens of C57BL6 mice and treated with H. felis antigen, PAM3CSK4, and LPS for 6h, 24h, and 48h. Afterwards, cells were collected at respective time points for mitochondrial mass and membrane potential staining by using Mitoview Green and Mitoview 633 or TMRE dyes respectively in the flow cytometry. The supernatant of these cells is used for the IL-10 ELISA experiments for checking their IL-10 secretion. H. felis, PAM3CSK4, and LPS-stimulated B cells increased their IL-10 production most noticeably at 24h and 48h indicating the suppressive capacity of that cells. Also, compared to the unstimulated control group, all of the stimulant groups increased both the mass and membrane potential of mitochondria at 24h and 48h time points. The second aim of our study was to investigate whether B cells with high mitochondrial membrane potential (Mitoview 633+ B cells) produce IL-10 or not. For that, after B cells were isolated from IL-10 GFP reporter (VertX IL10 egfp) mice, they were treated with H. felis antigen, PAM3CSK4, and LPS for 6h, 24h, and 48h. Mitochondrial membrane potential were analyzed by flow cytometry. Afterwards, at 6h, 24h and 48h we evaluated mitochondrial membrane potential of the IL-10 producing B cells with quadrant analysis using flow cytometry. At 6h time there were no significant changes on IL-10+ Mitoview 633+ B cells. But at 24h and 48h time points; H.felis, PAM3CKS4, and LPS-stimulated B cells increased IL-10+ Mitoview 633+ B cells. These data show that in all stimulated B cell groups; high portion of the IL-10 producing B cells also have high mitochondrial potential. Our data shows, H. felis, PAM3CSK4, and LPS-stimulated Mitoview 633 + B cells increased their IL-10 GFP signal both at 24h and 48h time points compared to the unstimulated control group. The third aim of our study was to investigate mitochondrial biogenesis markers: mtDNA:nDNA ratio and mitochondrial transcription factor A (Tfam) gene expression. To perform Q-PCR experiments isolated and treated B cells were collected for DNA and RNA isolation at 6h, 24h, and 48h. For mtDNA:nDNA ratio analysis in Q-PCR; respectively cytochrome c oxidase subunit I (COX1) and 18S ribosomal subunit gene (RPS18) were targeted by using gene-specific primers. While H. felis, PAM3CSK4, and LPS-stimulated B cells decreased their mtDNA:nDNA ratio, they increased Tfam expression level compared to the unstimulated control group. This study showed that H. felis-activated B cells have active/functional mitochondria, and increased oxidative phosphorylation for energy production and their IL-10 production can be related to their mitochondrial metabolism. | |||