| Tez Künye | Durumu | ||
| Involvement of SIK2 in FGF2 signal regulation via Raf-1 & generation of mutants for identification of phosphorylation sites on SIK2 by Erk / SIK2 proteininin Raf-1 proteini araciliğiyla FGF2 sinyal yönetimindeki görevi & SIK2 proteininin Erk proteini tarafindan fosforlanma motiflerinin belirlenmesi için mutant üretimi Yazar:ÖZDEN AKAY Danışman: PROF. KUYAS BUGRA BİLGE Yer Bilgisi: Boğaziçi Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Konu:Bilim ve Teknoloji = Science and Technology ; Biyoloji = Biology ; Genetik = Genetics Dizin:Blotting-western = Blotting-western ; Gen teknolojisi = Gene technology ; Hücre dizisi = Cell line ; MAP kinaz = MAP kinase ; Mutasyon = Mutation ; Protein analizleri = Protein analysis ; Protein profili = Protein profile ; Ras = Ras ; Sinyal nakli = Signal transduction ; İn vitro = In vitro | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2012 93 s. | ||
| Müller hücreleri çoğalımı Ras/MAPK yolağı üzerinden FGF2 sinyaliyle hızlı ve kısa süreli ERK1/2 aktivasyonuyla indüklenmektedir. Bir serin/treonin kinaz olan tuzla indüklenebilir kinaz 2 (SIK2), bu çerçevede yeni bir düzenleyicidir. Laboratuvar sonuçlarımız göstermiştir ki, SIK2 yolak üyesi Gab1’i Ser266 üzerinden fosforile ederek FGF2 sinyal iletimini baskılamada görev almaktadır. Ayrıca SIK2 bir diğer yolak üyesi olan Raf-1`i Ser621 üzerinden fosforile etmektedir. Bu araştırmada, Raf-1’in SIK2 tarafından fosforilasyonunun Raf-1 ve aşağı yönlü elemanlarının aktivitesi üzerinde negatif etkisi bulunduğunu öne sürülmektedir. Bunun analizi için, FGF2 ile uyarılmış kontrol ve SIK2 susturulmuş Müller hücrelerinde Raf-1 `in Ser621 üzerindeki 0 ile 120 dakika arasındaki zaman diliminde fosforilasyon düzeni incelenmiştir. Ayrıca, Raf-1 aktivitesi, Raf-1 substratı olarak kinaz inaktif MEK kullanılarak in vitro kinaz tayini ile analiz edilmiştir. Verilerimiz önermektedir ki, FGF2 uyarımının 10. dakikasında Raf-1’in SIK2 tarafından Ser 621 üzerindeki fosforilasyonu en yüksek seviyedeyken; 60. dakikada en düşük seviyededir. SIK2’nin susturulmuş olduğu hücrelerde Raf-1 aktivitesi 10. dakikada en yüksek seviyededir ve 60. dakikada bazal düzeye yakındır. Bu veriler SIK2’nin aktivasyon profili ile uyumludur. Bu durumda, 10. dakikada en yüksek aktivite seviyesine ulaşan SIK2’nin Raf-1 aktivitesini Ser621’i fosforile ederek baskıladığı sonucuna varılabilir. Raf-1 fosforilasyon durumu ve aktivitesi SIK2’nin en düşük aktivite düzeyinde olduğu 60. dakikada bazal düzeye yaklaşmaktadır. Araştırmanın ikinci kısmında, SIK2 mutantları oluşturularak, ERK tarafından SIK2’nin fosforilasyonu araştırılmıştır. Önceki verilerimize göre; ERK SIK2’yi FxFP motifine birleşik (S/T)P (DED domain) olan ERK fosforilasyon motifine dayanarak belirlenen 758 ve 863 numaralı 2 aday treonin üzerinden fosforile etmektedir. Bu fosforilasyon SIK2’nin aktivasyonu ve modülasyonu ile sonuçlanmaktadır. Hedef amino asitlerin belirlenmesinde ilk adım olarak, T863A SIK2 mutantı üretilmiştir. | |||
| Müller cell proliferation is induced by FGF2 signaling via Ras/MAPK pathway through rapid and transient ERK1/2 activation. Salt inducible kinase 2 (SIK2), a serine/threonine kinase, is a novel regulator in this context. Results from our laboratory implicate SIK2 in downregulation of FGF2 signaling through phosphorylation of adaptor protein, Gab1 on Ser266. SIK2 also phosphorylates another pathway element, Raf-1 on Ser621. In this study, we hypotesized that SIK2 phosphorylation of Raf-1 downregulates its activity and activation of downstream elements in FGF2 signaling. In this context modulation of Raf-1 phosphorylation on Ser621 was investigated in FGF2 treated control and SIK2 silenced Müller cells in a time course from 0 to 120 minutes. Raf-1 activity was analyzed by in vitro kinase assay using kinase inactive MEK as Raf-1 substrate. Our data revealed that Raf-1 phosphorylation on Ser621 reaches maximum level at 10 minutes and the minimum level at 60 minutes of FGF2 treatment. Raf-1 activity is the highest in SIK2 silenced cells at 10 minutes and close to basal level at 60 minutes. These data are in accordance with SIK2 activation profile. It can be concluded that SIK2 inhibits Raf-1 activity by phosphorylating it on Ser621 at 10 minutes when SIK2 has the maximum activity. Raf-1 phosphorylation status and activity approximates to basal levels at 60 minutes where SIK2 activity is at minimum level. In the second part of the study, phosphorylation of SIK2 by ERK was investigated through generation of SIK2 mutants. Our previous data shows that ERK phosphorylates SIK2 on two candidate threonines as 758 and 863 based on ERK phosphorylation motif, (S/T)P adjacent to FxFP motif (DED domain). This phosphorylation results in activation and modulation of SIK2. As a first step in identification of target residues, T863A SIK2 mutant was generated. | |||