| Tez Künye | Durumu | ||
| Liposome encapsulation overcomes D-type and K-type CpG ODN dichotomy and induces synergistic immune activation / Lipozoma yüklenmiş D-tipi ve K-tipi ODN’lerin sinerjik immun aktivasyonu Yazar:BEGÜM HAN HORULUOĞLU Danışman: PROF. DR. İHSAN GÜRSEL Yer Bilgisi: İhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2014 111 s. | ||
| Yüksek yükleme verimi ve güvenliği sayesinde, lipozomlar ; kararsız biyoaktif ajanların taşınmasında en iyi adaylardan biridir. İnsanda, yapı olarak farklı gruplandırılan CpG ODN’ler farklı sinyal yolaklarını aktive ederek, değişik immün cevaplara yol açarlar. K-tipi ODN plazmasitoid dendiritik hücrelerin (pDC) olgunlaşması ve aktifleşmesi sonucu TNFα salgılanmasına sebep olurken, D-tipi ODN IRF’ye bağımlı sinyal yolaklarını aktive ederek IFNα üretilmesine neden olur. Çarpıcı bir şekilde, K-tipi ve D-tipi ODN’ler serbest hallerinde hücrelere verildiklerinde, K-tipi D-tipi etkisini bloke eder ve sadece K-tipine özel cevap gözlemlenir. Her iki tip ODN için de en uygun ve en önemli özelliklerini kaybetmeyecekleri bir taşıyıcı sistemin geliştirilmesi klinik uygulamalar için çok önemlidir. Bu çalışmada, öncelikle K- ve D- tipi ODN’leri 5 farklı lipozoma yükleyerek sinerjik etkilerini araştırdık. Bu lipozomlara yüklü ODN’lerin insan periferik kan mononükleer hücreleri ve fare dalak hücreleri üzerinde sinerjik bir etki gösterebilme kabiliyeti en yüksek olan potansiyel gruplarını seçtik. İnsan periferik kan hücreleri üzerinde yapılan sitokin ELİSA deneyleri sonucunda, kullanılan 5 lipozomal kombinasyonun da serbest ODN’lere göre daha fazla IFNα ve TNFα ürettiğini gözlemledik. Serbest haldeki K-ve D-tipi ODN’ler beraber inkübe edildiklerinde beklendiği gibi D-spesifik olan IFNα salımında azalma gözlemlenmiştir. Nötral ve anyonik lipozoma yüklü D-tipi ODN (ND ve AD) ile katyonik lipozoma yüklü K-tipi ODN (CK) beraber hücreye verildiklerinde ise, K-tipi D-tipini engellemek yerine, hem K-tipine özgü etkiyi arttırmakta hem de D-tipine spesifik etkiler göstermektedir. Bu gelişmiş sinerjik etki, ND+CK grubunda TNFα salımı için kullanılan donörlerin %100’ünde gözlemlenirken, IFNα için %90’ında gözlemlenmektedir. Bunlara ek olarak, hücre içi sitokin boyama deney sonuçlarına göre TNFα ve IFNα sekresyonu özel olarak insan pDC’lerinden artmaktadır. Yardımcı uyaran molekül ifadeleri ve antijen sunucu hücrelerin de lipozomal kombinasyonlarda, serbest ODN’lere göre belirgin bir şekilde arttığı gözlemlenmiştir. Fare deneylerinde, insan deneylerinden farklı olarak ND+CK grubu yerine, K-tipi ODN yüklü sterik olarak stabilize edilmiş katyonik lipozom (SSCL) ile D-tipi ODN yüklü i) nötral, ii) anyonik, iii) katyonik ve iv) stealth kombinasyonlarında sinerjik etkiler görülmüştür (IL6, IL12 ve IFNγ üretiminde artış). Ex-vivo deneyleri sonucunda, lipozomal kombinasyonların CpG ODN’lerin hücre içine alımını ve proinflamatuar sitokinlerin gen ifadelerini arttırdığını ortaya çıkarmıştır. Bu çalışmada hem insan, hem de farede doğru lipozom tipi seçimiyle K-tipi ODN’in D-tipi ODN’e karşı gösterdiği antagonist etkiyi, sinerjik bir etkiye çevirebileceğimizi kanıtladık. Yaklaşımımız bu önemli iki tip ODN’in immunoterapötik uygulamalarda kullanımını arttırabilecek niteliktedir. | |||
| Liposomes are one of the best candidates for the encapsulation of labile bioactive agents due to their safety and high entrapment efficiency. In human, two structurally distinct classes of CpG ODN are capable of activating different signaling pathways, leading to differential immune activation. While K-type ODN triggers plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to mature and produce TNFα, D-type ODN leads to IRF-7 dependent IFNα secretion. Strikingly, when K-and D-type ODN are co-incubated in their free forms, K-ODN masks the D-ODN specific immune activation. Identifying proper delivery vehicles that provide both ODN types to display their superior features upon stimulation is of great clinical importance. In this study, first we investigated the synergistic effects of K- and D-ODN upon encapsulating them within five different liposome types. Then with the selected potential liposome combinations, we identified synergistic activation capacities both on human PBMCs and on mice splenocytes. In PBMC cytokine results revealed that D-ODN loaded in all five liposome types stimulated more IFNα than free D-ODN. Similarly, liposomal K-ODN triggered more TNFα than free K-ODN type. While incubation of free K and D- type ODN as expected, abrogated D-specific IFNα production from PBMC, simultaneous incubation with neutral or anionic D-ODN loaded liposomes plus cationic liposomes loaded with K-ODN significantly increased K-specific as well as D-specific effect rather than masking it (i.e. more production of TNFα and IFNα specific for K and D, respectively). This improved synergistic immune activity for both D and K ODN observed with ND+CK combination in 100% of individuals (TNFa) and 90% of individuals for IFNa. Additionally, intracellular cytokine staining findings supported improved TNFα and IFNα, from pDC population of PBMCs. Co-stimulatory molecule expressions and APC activation also significantly upregulated compared with free treatment. In mice contrary to ND+CK combination, sterically stabilized cationic liposome encapsulated K-ODN combined with i) neutral, ii) anionic, iii) cationic or iv) stealth encapsulated D-ODN increased IL6, IL12 and IFNγ levels, when stimulated simultaneously. Moreover, ex vivo experiments showed that cellular uptake and pro-inflammatory cytokine gene expressions significantly increased with combined liposomal formulations. This study established that by selecting proper liposome type(s) we reverse antagonistic action of K-ODN on D-ODN and induce a synergistic effect leading to a more robust immunostimulatory activity in both human and mice. This approach could broaden the immunotherapeutic application of these two important CpG ODN classes in clinic. | |||