| Tez Künye | Durumu | ||
| Site-directed mutagenesis of highly conserved residues in Helix IX of subunit I of cytochrome cbb3 oxidase from Rhodobacter capsulatus / Rhodobacter capsulatus?ta bulunan cbb3 oksidazın I. alt ünitesinin IX. heliksi üzerindeki oldukça korunmuş rezidülerinin yönlendirilmiş mutagenezi Yazar:ŞÜKRÜYE ER Danışman: YRD. DOÇ. MEHMET ÖZTÜRK Yer Bilgisi: Abant İzzet Baysal Üniversitesi / Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2010 127 s. | ||
| Oksijen redüktazlar; mitokondri, birçok aerobik bakteri ve arke’lerin solunum zincirinin son halkasını oluşturmaktadır. Yönlendirilmiş mutagenez deneyleri ve aa3-tipi oksijen redüktazların kristal yapıları oksijen redüktazların D- ve K- kanalı olarak adlandırılan iki proton transfer kanalına sahip olduğunu göstermektedir. Aspartik asit 361 (D361), glutamat 380 (E380) ve lizin 387 (K387) aa3 ve ba3-tipi oksijen redüktazların I. alt ünitelerinde (numaralandırma R. capsulatus’ a göre) oldukça korunmuş olarak bulunan amino asitlerdir. 380 glutamat bölgesindeki mutasyonlarının oksijenin indirgenmesi reaksiyonu ve proton alınımını durdurması, bu rezidünün aa3 tip oksidazların katalitik mekanizmasında önemli rol oynadığını göstermektedir. D361 and K387 amino asitlerinin de özellikle aa3 tip oksidazlarda oldukça korunmuş olduğu ve enzim aktivitesi üzerinde önemli roller oynadığı düşünülmektedir.Bunun dışında oksijen redüktaz’ların redoks merkezinin spektroskopik ve termodinamik özellikleri, bu üç rezidünün birçok enzimlerde de görülen histidine/glutamat/aspartat yapısal motifi için önemli olduğunu ortaya koymaktadır. Ancak katalitik alt ünitelerin amino asit dizi analizleri bu rezidülerin cbb3-tipi oksijen redüktazların VIII. heliks’inde korunmadığını göstermektedir. Bununla beraber, homoloji modellemeleri cbb3-tipi oksijen redüktazların I. alt ünitesinin IX. heliks’inde tamamen korunmuş olan D361, E380 ve K387′ nin bu fonksiyonu yerine getirdiğini düşündürmektedir.Bu çalışmada ayrıca proton pompalama kanalının moleküler mekanizmasını anlamak için, R.capsulatus’tan elde edilen cbb3-tipi oksijen redüktaz’ın I. alt ünitesindeki IX. heliks’te yer alan korunmuş olan aspartik asit, glutamat ve lizin amino asitleri yönlendirilmiş mutagenez tekniği kullanılarak sırasıyla asparjin (N), glutamin (Q) ve metiyonin (M)’ e dönüştürülmüştür. Mutasyonun enzim aktivitesi üzerindeki etkisi NADİ boyama ile tayin edilmiş ve E380Q mutantının tamamıyla inaktifken, D361N ve K387M mutantlarının yaban tip enzim aktiviteye sahip oldukları bulunmuştur. Sonuçlar cbb3-tipi oksijen redüktazların aa3-tipi oksijen redüktazlardaki D-kanalına benzer bir proton iletim kanalına sahip olduğu önerisini desteklemektedir. | |||
| Oxygen reductases are terminal respiratory oxidases in mitochondria and many aerobic bacteria and archaea. Site-directed mutagenesis experiments and the crystal structures of the aa3-type oxygen reductases revealed two proton transfer pathways, named the D- and the K-pathways. Aspartic acid 361 (D361), glutamate 380 (E380) and lysine 387 (K387) are highly conserved amino acid residues (R. capsulatus numbering) in the subunit I of the aa3 and ba3?type oxygen reductases. Mutations at glutamate 380 (E380) locus have been shown to block the oxygen reduction and the uptake of protons, suggesting that this residue plays an important role in the catalytic mechanism of aa3 type oxidases. D361 and K387 are also thought that highly conserved amino acids especially in aa3 type oxidase and play important roles on enzyme activity.Moreover, thermodynamic and spectroscopic properties of the redox centers in oxygen reductases indicated that these three residues were important for histidine-glutamate/aspartate structural motifs found in a variety of enzymes. A sequence comparison of the catalytic subunits shows that these residues are not conserved within VIII. helix of cbb3-type oxygen reductase. However, homology modeling has suggested that D361, E380 and K387 are located within helix IX of subunit I and fully conserved among the cbb3-type oxygen reductases, might fulfill this function.In the present study, in order to understand molecular mechanism of proton pumping channel, conserved aspartic acid, glutamic acid and lysine residues within helix IX of subunit I of the cbb3-type oxygen reductases from R. capsulatus were substituted for asparagine 361 (N361), glutamine 380 (Q380) and methionine 387 (K387) respectively by site directed mutagenesis. The effects of these mutations on enzyme activity were evaluated by NADI staining and it was found that while the E380Q mutant was completely inactive, other D361N and K387M mutant had wild type activity. The result supports the proposal that the cbb3-type oxygen reductases have a proton-conducting channel that is analogous to the D-channel in the aa3-type oxygen reductases. | |||