| Tez Künye | Durumu | ||
| The use of CRISPR/DCAS9 engineered mscs to prevent cisplatin-induced cellular damage in human granulosa cells / Sisplatin ile i̇ndüklenen insan granüloza hücrelerinde ki hücre hasarini önlemek için CRİSPR/DCAS9 tasarlanmiş MSC’lerin kullanimi Yazar:MEHMET YUNUS ÇOMAR Danışman: DR. SERÇİN KARAHÜSEYİNOĞLU Yer Bilgisi: Koç Üniversitesi / Sağlık Bilimleri Enstitüsü / Üreme Biyolojisi Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology ; Biyoteknoloji = Biotechnology ; Kadın Hastalıkları ve Doğum = Obstetrics and Gynecology Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans İngilizce 2022 108 s. | ||
| Kemoterapiye bağlı yumurtalık hasarı, kadınlarda kemoterapi alan kadınlarda yumurtalıkların işlevini geçici veya kalıcı olarak yitirebildiği bir durumdur ve yumurtalık disfonksiyonunda düşük östrojen serum seviyesi, amenore ve infertilite gibi belirtiler görülebilir . Cisplatin, tüm yumurtalık hücreleri üzerinde gonadotoksik etkisi olan platin bazlı bir antikanser kemoterapötik ilaçtır. Kök hücreler, özellikle yetişkin bir kök hücre olan mezenkimal kök hücreler kemoterapiye bağlı yumurtalık hasarı için yardımcı bir tedavi olarak denenmektedir. CRISPR genom düzenleme teknolojisi, en yaygın olarak kullanılan gen düzenleme sistemidir ve nükleaz etkisinden yoksun dCas9 (ölü Cas9), bir CRISPR aktivasyon aracıdır. Bir sinerjistik aktivasyon aracısı (SAM), iki MS2 aptameri dahil olmak üzere modifiye edilmiş bir sgRNA ile entegre edilmiş dCas9-VP64 füzyon proteininden oluşan bir CRISPR/dCas9 aktivasyon sistemidir. MS2 bağlayıcı proteini, diğer iki aktivatör alanı olan p65 ve HSF1 ile birleştirilir ve bu füzyon proteini (MS2-p65-HSF1), MS2 aptamerleri ile etkileşime girer. Bu şekilde daha yüksek bir gen aktivasyonu sağlanmış olur. Eksozomlar, 20-200 nm arasında değişen ve biyolojik sıvılardan izole edilebilen hücre dışı veziküllerdir. Eksozomlar mRNA, uzun kodlamayan RNA, mikroRNA’lar, proteinler ve lipitler içerirler. Eksozomlar, hücreler arası iletişimde, hücrelerin gen ve protein ekspresyon sinyallerini iletmede önemli bir rol oynarlar. Bu çalışmanın amacı, dCas9 ile genomu düzenlenmiş MSC’leri sisplatine reve eksozomlarını üreterek ve bu hücrelerin daha dirençli veya kemoterapötik, sisplatin olup olmadığını test etmektir. Bu çalışmanın amacı CRISPR/ dCas9 genom düzenleme aracı ile MSC hücrelerini sisplatine karşı dirençli hale getirmek ve ardından bu hücreleri ve bu hücrelerden elde edilmiş eksozomları kemoterapiye bağlı yumurtalık hasarını korumaya yönelik kullanmaktır.SAM aktivatör sistemi kullanılırak CD99 geni aktive edildi sisplatine karişı dirençli mezenkimal kök hücreler elde edildi. Ardından normal ve dirençli mezenkimal kök hücrelerden ayrı ayrı eksozomlar izole edildi. Daha sonra bu hücrelerden sferoidler elde edildi. “Transwell” kültür tabaklarının alt kısmında deneysel tedavi grupları ve üst kısmında(insert) hGRC1 (insan granuloza hücre dizisi) hücreleri kullanılarak ko-kültürler oluşturuldu. Ko-kültürler oluşturulduktan sonra hücreler sisplatine maruz bırakıldı. hGRC1 hücreleri sırasıyla 24, 48, 72 ve 96 saat sonra toplandı. İlk olarak, toplanan hücreler de canlılık testi yapıldı. Daha sonra qPCR ile inflamasyon ve apoptoz belirteçleri olan IL-10, IL-1Ra, Bax ve Bcl-2 genlerinin ifadeleri analiz edildi. Sonuç olarak, tüm deney gruplarında kontrol grubuna göre daha fazla canlı hücre olduğu, her saat grubunda inflamatuar ve apoptoz değerlerinin düştüğü gözlemlendi. Ayrıca dirençli hücrelerin, dirençli olmayan hücrelere göre daha etkili bir koruma sağladığı görüldü. Diğer deney gruplarına göre önemli ölçüde daha fazla koruma sağlayan grup, dirençli mezenkimal kök hücreleri ve bu hücrelerden izole edilen eksozomların birlikte kullanıldığı grup olmuştur. Bu sonuçlar sisplatin gibi kemoterapötiklerle dirençli hale getirilmiş mezenkimal kök hücrelerin ve onların eksozomlarının kullanımının granuloza hücrelerini koruyabileceğini göstermesi açısından önemlidir. Anahtar Kelimeler: Mezenkimal Kök Hücreler, İnfertilite ,CRISPR/dCas9, Eksozomlar, Kanser | |||
| Chemotherapy-induced ovarian failure (COF) can cause ovarian dysfunction diseases in which the ovaries temporarily or permanently stop functioning due to chemotherapy. Low estrogen serum levels and amenorrhea are infertility signs may contribute the clinical appearance of COF. Cisplatin is a platinum-based anticancer chemotherapeutic drug that has a gonadotoxic effect on all ovarian cells. Stem cells, especially mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from different adult tissues, have been tried as an adjunct therapy for COF. CRISPR genome editing technology is the most broadly used gene editing system, and dCas9 (dead Cas9) is a targeted CRISPR activation tool that lacks the nuclease effect. A synergistic activation mediator (SAM) is a type of CRISPR/dCas9 activation system composed of the dCas9-VP64 fusion protein integrated with a modified sgRNA, including two MS2 aptamers. MS2 binding protein is fused with two other activator domains, p65 and HSF1, and this fusion protein (MS2-p65-HSF1) interacts with MS2 aptamers. Exosomes are extracellular vesicles that range between 20–200 nm and can be isolated from biological fluids. They contain mRNA, long non-coding RNA, microRNAs, proteins, and lipids. Exosomes play an essential role in intercellular communication, in delivering gene and protein expression signals of cells. The aim of this research is to produce dCas9 genome edited MSCs and their exosomes and to test whether these cells are more resistant or chemotherapeutic, cisplatin, or not. Cisplatin-resistant mesenchymal stem cells were obtained by activating the CD99 gene with the SAM activator system. Then, exosomes were obtained from normal and resistant mesenchymal stem cells separately. Later, spheroids were formed with these cells. Co-cultures of MSCs were established with the experimental treatment groups at with hGRC1 (human granulosa cell line) cells in the insert using the Transwell aid. After the co-cultures were established, the cells were exposed to cisplatin. After that, hGRC1 cells were harvested at 24, 48, 72, and 96 hours, respectively. Firstly, a cell viability assay was performed on the collected cells. Then, by qPCR the expression of inflammatory or apoptotic markers as IL-10, IL-1Ra, Bax, and Bcl-2 genes was analyzed. As a result, it was observed that there were more viable cells in all experimental groups compared to the control group, and inflammatory and apoptosis values decreased in each hour group. And it was also discovered that resistant cells have provided a more effective protection than the non-resistant cells. The group that provides the most significant protection compared to all other experimental groups is the group that uses resistant mesenchymal stem cells and exosomes isolated from these cells, and this finding is important as it can be interpreted that the use of resistant mesenchymal cells with their exosomes can be an alternative adjunct therapy to protect ovarian granulosa cells during the use of cisplatin like chemotherapeutics for cancer. Keywords: Mesenchymal Stem Cells, Cisplatin, CRISPR/dCas9, Exosomes, Cancer, Infertility | |||