| Tez Künye | Durumu | ||
| Yerel Bacillus izolatlarının tiplendirilmesinde moleküler biyolojik yaklaşımlar / Molecular biological approaches in typing endemic Bacillus isolates Yazar:ŞAZİYE SERDA KAYMAN Danışman: YRD. DOÇ. DR. SALİHA İŞSEVER ÖZTÜRK Yer Bilgisi: Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü / Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü / Biyoloji Ana Bilim Dalı Konu:Biyoloji = Biology Dizin: | Onaylandı Yüksek Lisans Türkçe 2007 236 s. | ||
| DNA düzeyindeki farklılıkları saptamak için kullanılan genotipik tiplendirme yöntemlerinin ayırt ettirici özelliği klasik tiplendirme yöntemlerine görece çok yüksektir. Bu tez çalışması kapsamında, daha önce ?-amilaz, alkalen proteaz ve lipaz üretkenliklerine göre seçilmiş ve manuel testler ile ticari kitler kullanılarak ön tiplendirilmeleri yapılmış olan 25 yerel Bacillus izolatının 16S rDNA dizi analizi, ARDRA ve ribotyping moleküler tiplendirme yöntemleri kullanılarak adlandırılması ve bu yöntemlerin G.Y.T.E. Biyoloji Bölümü Enzim Moleküler Genetiği Laboratuvarında rutin olarak kullanımının sağlanması hedeflenmiştir. Bu hedefler doğrultusunda gerçekleştirilen çalışmalarda Bacillus Genetic Stock Center (BGSC)’dan sağlanan Bacillus soyları referans olarak kullanılmıştır. Yerel Bacillus izolatlarının PCR ile çoğaltılan 16S rDNA’larının dizilimleri CEQ8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter®) cihazı kullanılarak belirlenmiştir. Elde edilen 16S rDNA baz dizilimleri NCBI BLAST hızlı tarama programı kullanılarak GenBank veri tabanındaki nükleotit dizileriyle ?align? edilmiş ve yerel izolatların en yüksek benzerlik gösterdikleri Bacillus türleri belirlenmiştir. 25 yerel izolattan 21’i için atanan tür adları, manuel ve ticari kitler ile elde edilen sonuçlara göre önerilen olası tür adları ile uyumlu sonuçlar veriştir. Farklı bulunan izolatlardan P20 B. cereus grubu, P22 B. flexus, A28 ve A26 ise B. subtilis ile benzerlik göstermiştir. Referans Bacillus soyları eşliğinde gerçekleştirilen 16S ve rrn ARDRA çalışmalarında Sau3AI, MboII ve CfoI restriksiyon enzimleri kullanılmıştır. rrn operonunu çoğaltmaya yönelik PCR’larda özgül olmayan ikinci bir ürün gözlenmiş, PCR koşullarını optimize etmeye yönelik gerçekleştirilen çeşitli denemelere (enzim, primer tutunma sıcaklığı, PCR döngüleri, termal döngü cihazı, kalıp DNA’nın v özütlenme yöntemi vb.) karşın bu ürünün çoğalması engellenememiştir. Bu nedenle, rrn ARDRA çalışmaları, hem tüm izolat ve referans soyları içerecek şekilde saf olmayan rrn-PCR ürünleri ile hem de seçilen 11 yerel izolat ve 10 referans soyun jelden izole edilen 4,5 kbç büyüklüğündeki rrn operonları ile gerçekleştirilmiştir. rrn-ARDRA jel profilleri, Vilber Lourmat Jel Görüntüleme Sistemi ile görüntülendikten sonra sistem yazılımı BIO 1D++ ile, UPGMA (unweighted pair group match avarage) yöntemi kullanılarak dendogramlara dönüştürülmüştür. 16S ARDRA profilleri ise, o dönemde uygun görüntüleme sistemi ve yazılımı bulunmadığı için, gözle incelenerek tablolaştırılmış ve referans soylarla benzerlikleri irdelenmiştir. EcoRV, ClaI ve HindIII enzimlerinin kullanıldığı ribotyping çalışmaları kapsamında, rrn operonuna yönelik 5 primerden oluşan OligoMiks-5’in, ?DIG Oligonucleotide Tailing Kit? (Roche) kullanılarak DIG-dUTP ile veya T4 polinükleotit kinaz kullanılarak [?-33P]ATP ile işaretlendiği denemeler gerçekleştirilmiştir. Her iki yöntemle de, pozitif kontrol olarak kullanılan 16S rDNA ve filtre üzerindeki belirli bir bölgede alınan spotlar, oligonükleotitlerin etkin şekilde işaretlendiğine ve özgül olarak 16S rDNA dizilerine tutunduğunu göstermiştir. Ribotyping ve rrn-PCR yöntemlerine yönelik optimizasyon çalışmaları devam etmektedir. Gerekli alt yapının tamamlanmasının ardından AFLP, DNA-DNA hibridizasyonu gibi ayırt ettiriciliği geçerli diğer yöntemlerin de yerel Bacillus izolatlarının moleküler tiplendiriminde kullanılması planlanmaktadır. Buraya dek yapılan çalışmalardan elde edilen bulgular, P20 ve P22 soyları için daha önce önerilen tür isimlerinden bütünüyle farklı türlere işaret etmektedir. Diğer moleküler temelli analizler sonucu elde edilecek veriler özellikle bu iki izolatı sınıflandırmak adına ayrıca önem taşımaktadır. | |||
| Genotipic typing methods which are used for detecting differences at DNA level has a relatively higher discriminatory power than the classical typing methods. The aim of this study was to identify 25 endemic Bacillus isolates, that are previously selected on the basis of ?-amilase, alkaline protease and lipase productivity and preliminarily typed by using manual tests and commercial kits, by 16S rDNA sequencing, ARDRA and ribotyping methods and to ensure rutin utilization of these methods in Gebze Institute of Technology, Biology Department, Enzyme Molecular Genetics Labortory. In studies carried out to achive these goals, Bacillus species supplied by Bacillus Genetic Stock Center (BCGS) were used as referances. PCR amplified 16S rDNA sequences of the endemic Bacillus isolates were obtained by CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter®). These 16S rDNA sequences were aligned against the nucleotide sequences in the GenBank database using NCBI BLAST tool and the highest similarities were determined. When the potential species names assigned depending o the results of the manual tests and commercial kits evaluated 21 names out of 25 were matching. However, P20 seemed to be a member of the B. cereus group, P22 showed maximum similarity with B. flexus, while A28 and A26 isolates were similar to B. subtilis. Reference Bacillus species accompaniment to the endemic isolates were included in 16S and rrn-ARDRA studies and Sau3AI, MboII and CfoI restriction enzymes were used for the analysis. During the experiments of PCR amplification of the rrn operon, amplification of a second unspecific product was observed. Despite the effort to optimize the PCR conditions (enzyme, primer annealing temperature, PCR cycles, PCR machine, the extraction method of the template DNA), the production of the unspecific PCR pruduct couldn?t be prevented. Therfore, rrn vii ARDRA studies were carried out, including all the endemic isolates and reference species, with both impure rrn PCR products and the 4,5 kb rnn-operons of selected 11 endemic isolates and 10 reference species which are derived from the gel. rrn- ARDRA gel profiles were converted into denogrames with BIO 1D++ system software using UPGMA (unweighted pair group match average) method after image capturing with Vilber Lourmat Ifinity-3026 WL/26M. 16S ARDRA profiles were visually evaluated because of the lack of such a system then. In ribotyping studies EcoRV, ClaI and HindIII enzymes were used and Oligomix-5, which is consisting of five primers targeting the rrn-operon, was labeled with both DIG-dUTP and ?-33P-ATP in seperate experiments. With both approaches banding patterns obtained only for 16S rDNA which was used as a positive control and in a small area on the membrane. These results indicate that the oligonucleotides were effectively labeled and specifically binding 16S sequences. The optimization studies for ribotyping and rrn-PCR still last. Methods such as AFLP and DNA-DNA hybridization has a high discriminatory power and we are planning to use these methods in molecular typing of endemic Bacillus iolates, too. Evaluation of the results obtained with all of the methods performed showed that P20 and P22 isolates are showing no match with the preliminary typing results. Utilization of other molecular typing methods would be valuable esecially for these two isolates. | |||